Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Rachel Santarella-Mellwig; Uta Haselmann; Nicole L. Schieber; Paul Walther; Yannick Schwab; Claude Antony; Ralf Bartenschlager; In&#233;s Romero-Brey

doi:10.3791/58154

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biotechnik

Oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) voor het bijhouden en Imaging virale eiwitten verbonden structuren in Cryo-geïmmobiliseerd cellen

Published: September 07, 2018

doi:

10.3791/58154

Rachel Santarella-Mellwig¹, Uta Haselmann², Nicole L. Schieber¹, Paul Walther³, Yannick Schwab¹, Claude Antony¹, Ralf Bartenschlager^2,4, Inés Romero-Brey²

¹European Molecular Biology Laboratory, ²Department of Infectious Diseases, Molecular Virology,Heidelberg University, ³Central Facility for Electron Microscopy,Ulm University, ⁴Heidelberg Partner Site,German Center for Infection Research

Summary

Een oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) methode wordt toegepast op afbeelding virus-geïnduceerde intracellulaire structuren via elektronenmicroscopie (EM) in de cellen die eerder door de lichte microscopie (LM) zijn geselecteerd. LM en EM worden gecombineerd als een hybride beeldvorming aanpak om een geïntegreerde visie van virus-gastheer interacties.

Abstract

Als gevolg van de hoge resolutie is elektronenmicroscopie (EM) een onmisbaar hulpmiddel voor virologen. Een van de belangrijkste problemen bij het analyseren van virus-geïnfecteerde of transfected cellen via EM zijn echter de lage efficiëntie van infectie of transfectie, het onderzoek van deze cellen belemmeren. Om deze moeilijkheid te overwinnen, kan de lichte microscopie (LM) eerst worden uitgevoerd om de subpopulatie van besmette of transfected cellen toewijzen. Zo profiteren van het gebruik van fluorescente proteïnen (FPs) gesmolten aan virale eiwitten, LM wordt hier gebruikt om op te nemen van de standpunten van de “positieve-transfected” cellen, uiting geven aan een FP en groeien op een ondersteuning met een alfanumeriek patroon. Vervolgens cellen worden verder verwerkt voor EM via hogedruk bevriezing (HPF), bevriezen van substitutie (FS) en hars inbedding. De ultra snelle bevriezing stap zorgt voor uitstekende membraan behoud van de geselecteerde cellen die kunnen vervolgens worden geanalyseerd op ultrastructureel niveau door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Hier, wordt een stapsgewijze oereenstemming licht-elektronenmicroscopie (CLEM) workflow verstrekt, bereiding van de monsters, beeldvorming en correlatie in detail beschrijven. De proefopzet kan ook worden toegepast om aan te pakken veel cel biologie vragen.

Introduction

Het idee van het combineren van twee microscopie modaliteiten te verkrijgen van een beter beeld van een specifieke biologisch proces is vrij oud. Dus, de allereerste studie over virussen met behulp van “oereenstemming microscopie” werd gepubliceerd in 1960 als twee aparte publicaties¹^,². In deze studie analyseerde de auteurs de veranderingen in de morfologie van de kern geïnduceerd door adenovirussen door middel van twee microscopie technieken. In de eerste publicatie waren elektronenmicroscopie (EM) opmerkingen met een beschrijving van de morfologische details adenovirus infectie gekoppeld gerapporteerde¹. In een tweede publicatie, werden de verschillende structuren waargenomen door EM gecorreleerd met lichte microscopie (LM) beelden van histochemische kleuring patronen, vast te stellen van de aard van de structuren die eerder waargenomen door EM².

In deze vroege studies, werden hun opmerkingen echter uitgevoerd met behulp van verschillende geïnfecteerde cellen bereid als onafhankelijke experimenten. De “correlatie” was, inderdaad, bedoeld als de combinatie van informatie die afkomstig is uit twee beeldvormende modaliteiten te begrijpen van een bepaalde verschijnsel, alle bevindingen die zijn verkregen met verschillende testen om te begrijpen van een bepaalde biologische vergelijken proces.

Tegenwoordig wordt de term oereenstemming microscopie, ook bekend als oereenstemming licht- en elektronenmicroscopie (CLEM), toegepast op een toenemend aantal methoden (herzien in verwijzingen³^,⁴^,,⁵), met de gemeenschappelijkheid dat beide beeldvormingstechnieken (LM en EM) worden uitgevoerd op de zeer dezelfde steekproef. De combinatie van beide methoden resulteert daardoor in een multimodale Multi-Scale en multi-dimensionale analyse van dat monster³. De voordelen zijn dat LM een breed overzicht van vele verschillende cellen bieden kan, waardoor de identificatie van cel subpopulaties uiting van een eiwitten of proteïnen van belang in een heterogene-celpopulatie. EM overwint de resolutie limiet van LM, bieden een hogere resolutiebeeld van een bepaalde intracellulaire gebeurtenis. EM maakt bovendien de visualisatie van de niet-belichting fluorescerende subcellular context, met inbegrip van alle membraan gebonden organellen, grote macromoleculaire complexen (bijvoorbeeld ribosomen, centrioles, enz.) en cytoskeletal elementen, waardoor aanvullende ruimtelijke informatie, de zogenaamde “verwijst naar ruimte”,⁶, en geven context naar de fluorescerende plek gedetecteerd door LM.

Tijdens de laatste jaren, CLEM is uitgegroeid tot een krachtig instrument, niet alleen voor cel biologen⁵, maar ook voor virologen (herzien in referentie⁷) bereid zijn om te begrijpen van de complexe virus-cel interactie die tot een succesvol virus verspreiding leiden. Begrijpen hoe virussen wijzigen celmembranen en organellen in hun eigen voordeel is dus essentieel voor het ontwikkelen van antivirale middelen voor de uitroeiing van pathogene virussen.

Hier, wordt een CLEM methode beschreven waarmee de detectie door LM van cellen uiten van virale eiwitten gesmolten aan een fluorescente proteïne (FP). Deze cellen zijn vervolgens cryo-geïmmobiliseerd en verder voorbereid voor Ultrastructurele analyse via transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) te krijgen van nieuwe inzichten in hoe de expressie van deze proteïnen herschikken intracellulaire membranen (Figuur 1). CLEM is uitgevoerd met chemisch vaste cellen in de meeste van de virologie studies gepubliceerd naar datum⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴ ^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Dit is voornamelijk te wijten aan de noodzaak van het inactiveren van besmettelijk materiaal voor bioveiligheid redenen in biosafety level-2 en -3 (BSL-2 en BSL-3) laboratoria, waar cryo-immobilisatie van cellen meestal niet mogelijk is. Deze vragen vereisen een optimaal behoud van de celmembranen, is, verglazing via hogedruk bevriezing (HPF) echter raadzaam²⁰. In deze gevallen, kan het protocol van de CLEM hier beschreven worden toegepast. Interessant, met name bij het werken met infectieuze specimens, kan HPF worden uitgevoerd op monsters die eerder chemisch geïnactiveerd, bijvoorbeeld in BSL-2 en3 BSL laboratoria zijn. De combinatie van chemische fixatie gevolgd door HPF is een mogelijkheid om op zijn minst gedeeltelijk profiteren van de voordelen van cryo-behoud methoden²¹^,²².

Figuur 1 : Schematische weergave van de workflow voor de analyse van cellen via CLEM. Cellen groeien op patroon saffier schijven worden eerst geanalyseerd door LM te lokaliseren cellen uiten FPs vóór de verwerking ervan voor EM. Zodra gevonden, worden cellen meteen opgelost door HPF en FS vervolgens in de hars ingesloten. Bij de polymerisatie van de hars, de steun waar de cellen groeiden (= saffier schijven) moeten worden verwijderd uit het blok hars. Het blok met de ingesloten cellen is bijgesneden tot een kleine trapezium waaruit de resterende cellen, uiting van FPs, met een mes van de diamant worden gesegmenteerd. Uiterst dunne secties worden verzameld op slot rasters en verder onderzocht door TEM ultrastructurele informatie verkrijgen van deze cellen. Dit cijfer is aangepast en bewerkt met toestemming van referentie²⁹. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Protocol

1. voorbereiding voor patroon Sapphire schijven voor celkweek Pipetteer de patroon sapphire-schijven (Zie Tabel van materialen), met een alfanumeriek patroon geëtst op een van hun oppervlakken, in een tube van 15 mL conische centrifugeren.Opmerking: U kunt ook conventionele 0,05 mm dik saffier schijven zonder alfanumeriek patroon kunnen worden gebruikt waarin een verwijzing patroon is gemaakt door carbon coating hen met een rooster van de finder op de top. Voor dit doel, moeten zij worden gereinigd met ethanol voordat het carbon patroon wordt toegepast. Was ze grondig met ethanol. Hen die verspreid in een petrischaal met filtreerpapier en laat ze drogen. Plaats ze op een glasplaatje los van elkaar met behulp van slanke lange pincet. Neem contact op met een omgekeerde Microscoop (4 X vergroting) of het patroon van coördinaten goed leesbaar op elke saffier schijf is.Opmerking: Als dit niet het geval, spiegelen de saffier schijven met behulp van de pincet. De saffier schijven worden opgeslagen in een petrischaal.Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. 2. celkweek met gedessineerde saffier schijven Het steriliseren van de patroon saffier discs met een ultraviolet (UV) crosslinker voor 5 min. Neem de saffier schijven naar de cel cultuur bioveiligheid kabinet. Het steriliseren van de lange pincet met ethanol in de bioveiligheid kabinet. Voeg de helft van het kweekmedium cel (Zie Tabel van materialen) aan een cel cultuur schotel. Pipetteer de saffier schijven zorgvuldig met de lange pincet in de cel cultuur schotel. Zaad 1 x 105 Huh7-Lunet cellen, stabiel uiten de T7 polymerase geresuspendeerde in de andere helft van het kweekmedium cel, op de schotel van cultuur.Opmerking: Het aantal cellen worden overgeënt op zodanige wijze dat op het eindpunt van het experiment de cel confluentie moet berekenen niet meer dan 20-30%. Hoge celdichtheid zal belemmeren de verplaatsing van de cellen in latere stadia door EM. Bovendien kan over-confluentie resulteren in het detachement van cellen uit de saffier schijven. Controleer dat de saffier schijven aan de onderkant van de schotel cultuur blijven en dat de alfanumerieke coördinaten nog steeds leesbaar met de omgekeerde Microscoop zijn.Opmerking: Als de schijven in het kweekmedium cel zweven, gebruiken de lange pincet te duwen de schijven aan de onderkant en uiteindelijk te spiegelen ze terug naar de juiste stand. Transfect de cellen de volgende dag zoals eerder gemeld in verwijzingen21,23 volgens de instructies van de fabrikant van de transfectie agent. 3. LM beeldvorming van cellen groeien op patroon saffier schijven De saffier schijven op het eindpunt van het experiment overbrengen in een metalen imaging plaat met 30-50 µL / positie van pH-indicator-gratis medium om niet-specifieke achtergrond fluorescentie.Opmerking: De metalen plaat die hier beschreven (Figuur 2) is ontwikkeld in het Europese laboratorium voor moleculaire biologie (EMBL)-atelier. Bij gebrek aan deze plaat of een soortgelijke, kunnen glazen-bodem cel cultuur gerechten ook worden gebruikt in plaats daarvan voor LM. Het is belangrijk om te veranderen het kweekmedium normale cel voor medium zonder pH-indicator. Merk ook op dat lange belichtingstijden moeten worden vermeden omdat ze photobleaching, wat leidt tot accumulatie van reactieve zuurstof soorten (ROS) en fysiologische schade van de cellen24,25zou kunnen veroorzaken. Het imago van de cellen onder een omgekeerde widefield fluorescentie Microscoop.Opmerking: Bij gebruik van een groen fluorescente proteïne (GFP)-tagged eiwit, zoals wordt weergegeven in de representatieve resultaten, 450 – 490 nm en 500-550 nm excitatie en emissie filters, respectievelijk, moet worden gebruikt. Verwerven eerst een lage vergroting afbeelding (10 – 20 X) van de cellen toe te wijzen cellen uiten FPs. Record de coördinaten van de patroon saffier schijven waar de cellen van belang met behulp van differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie zich bevinden.Opmerking: Stitching verschillende gebieden kan helpen om een beter overzicht van de locatie van de cel/cellen van belang. Opmerking die ook dat fase contrast microscopie optioneel worden hier gebruikt kan. Verwerven van hoge vergroting (fluorescentie en DIC) beelden (63-100 X, olie-immersie doelstellingen) van dezelfde cel/cellen beter onderscheiden de subcellular localisatie van de proteïne van belang binnen de intracellulaire ruimte.Opmerking: DIC beelden contextuele informatie verschaffen. Deze informatie is vaak essentieel voor het correleren van LM beelden met EM microfoto later omdat de definitieve correlatie nauwkeuriger met “anatomische” monumenten van de cel is. Als sommige saffier discs tijdens cryo-immobilisatie breken kunnen, is het sterk aanbevolen om het bereiden van triplicates per voorwaarde. Bovendien, sommige cellen losmaken van de schijven tijdens HPF en de opeenvolgende stappen van dit protocol, terwijl de ultrastructuur van andere cellen bevatten artefacten als gevolg van de bevriezing van de schade. Daarom moeten ten minste twee gebieden van de schijven worden beeld via LM om ervoor te zorgen dat uiteindelijk zal er genoeg cellen die moeten worden geanalyseerd. Nog belangrijker is, moeten deze twee gebieden aan weerszijden van de schijf. Op deze manier het blok van de hars waarbij de cellen zijn ingesloten kan worden gesneden in twee helften en secties van deze gebieden kunnen worden verkregen. Figuur 2 : Schema voor de beeldvorming van de LM van cellen groeien op patroon saffier schijven. (A) de saffier schijven worden overgebracht met behulp van fijne pincet naar een imaging plaat. (B-C) Deze plaat is speciaal ontworpen op de workshop EMBL in Heidelberg te passen in de lichte Microscoop, waar de saffier schijven kunnen worden beeld met cel kweekmedium zonder pH-indicator. Het bestaat uit een metalen dia 75 mm x 25 mm x 1 mm, met vier-vijf gaten met een 3 mm boor past de grootte van de saffier schijven erin gefreesd. Daarnaast werden kleine groeven gemalen aan weerskanten van de gaten onder een hoek van 90°. Deze gaten wordt het gemakkelijker toegang tot de schijven met een tang wanneer ze manipuleren. Als u wilt toestaan voor optimale imaging voorwaarden werden glas coverslips No. 0 (0.085 aan 0.13 mm dik) gelijmd onder de gaten met UV lijm en geplaatst onder UV-licht te verharden. (D) hoge vergroting afbeelding van het patroon saffier schijf beeltenis van de alfanumerieke coördinaten die zijn geëtst op het oppervlak. De patroon saffier schijven zijn commercieel verkrijgbaar (Zie Tabel van materialen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 4. Cryo-immobilisatie van cellen groeien op patroon Sapphire schijven via HPF Plaats van de “A” en “B” aluminium dragers voor HPF (Zie Tabel van materialen) in een petrischaal met filtreerpapier doorweekt met 1-hexadecene. Dompel de patroon saffier schijven met de cellen in een petrischaal met 1-hexadecene.Opmerking: Verplaats de schijven een beetje het kweekmedium cel om weg te wassen. Het monteren van de saffier schijven tussen een “A” en een “B” aluminium vervoerder in de houder van het HPF als volgt (Figuur 3B). Plaats op de bodem, een “B” luchtvaartmaatschappij met de vlakke kant naar boven. Plaats de saffier schijven op deze vlakke kant met de cellen die naar boven zijn gericht. Voeg een “A” vervoerder met haar 0.1 mm diepte geconfronteerd met de cellen.Opmerking: Omdat de patroon saffier schijven dikker dan de conventionele saffier schijven zijn, de verkrijgbare “A” vervoerder (ontworpen voor gebruik met niet-patroon 0.05-mm saffier schijven) moest worden gesneden tot 0,05 mm aan deze kant van 0,2 mm diepte op het EMBL workshop om te passen in de houder van het HPF (Figuur 3A). Voor dit doel, wordt de “A” vervoerder ingevoegd in het einde van een metalen buis, zodat zijn 0,2 mm kant is blootgesteld en blijft nog steeds terwijl het kappen. De cut keerzijde is vervolgens geschuurd zodat het is plat. Als alternatief, een speciale aluminium-transporteur kan worden gebruikt op de top van de patroon saffier schijf (commercieel beschikbaar, Zie Tabel van materialen), in dit geval de HPF “sandwich” maximumzuurgraad alleen van de saffier disk en deze luchtvaartmaatschappij. Sluit de kaarthouder van de HPF machine en bevriezen van de cellen.Opmerking: Dit protocol is specifiek voor een bepaalde machine van het HPF. Andere machines HPF zou als alternatief gebruikt6,26. In ieder geval, wees u ervan bewust van het bestaan van nieuwe generatie machines van de leveranciers.Let op: Gebruik een veiligheidsbril en hoofdtelefoon van de bescherming van de hoorzitting. Plaats de bevroren “sandwich” in een polystyreen doos met vloeibare stikstof voor tijdelijke opslag.Let op: Gebruik bril en neem contact op met de lokale veiligheidsverantwoordelijken worden geïnformeerd over de potentiële gevaren bij de behandeling van de vloeibare stikstof. Om verwarring te voorkomen, plaatst u elke “sandwich” in een aparte 0,5 mL microcentrifuge buis (in de polystyreen doos) gemarkeerd met een nummer.Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Als bevriezing vervanging (FS) kan niet onmiddellijk worden uitgevoerd, de monsters kunnen worden opgeslagen in cryo-buizen (met een gat sloeg in de top) binnen de vakken die worden gehouden in een rek in een cryogene vloeibare stikstof dewar (Zie Tabel van materialen). Deze vloeibare stikstof-container moet worden gevestigd in een kamer met gas zuurstofsensoren, om te voorkomen dat verstikking in geval van een zuurstoftekort.Let op: Alle procedures beschreven hieronder (stap 5 en 6) moeten worden uitgevoerd in een kabinet bioveiligheid. Bovendien zijn de meeste van de gebruikte reagentia gevaarlijke. Alvorens deze te gebruiken, is het verplicht om Lees aandachtig het materiaal veiligheidsinformatiebladen die door fabrikanten, evenals de veiligheidsverantwoordelijken vragen over de lokale regels om ervoor te zorgen veilig en gezond omgaan. Voor de juiste verwijdering van deze gebruikte materialen, alsook voor het juiste gebruik van de apparatuur die hieronder worden beschreven, is het ook vereist voor het raadplegen van het lokale Instituut gezondheids- en veiligheidsprocedures. Figuur 3 : Schema van de vergadering voor patroon sapphire schijven tussen twee aluminium dragers voor HPF. (A) opengewerkte weergaven van een conventionele “A” vervoerder, dat worden gesneden kwartslag dieper van 0,2 mm tot 0,05 mm. (B moet) de 0.16 mm dikke saffier disc met een alfanumeriek patroon op het oppervlak geëtst is samengevoegd tot twee aluminium dragers voor HPF , als volgt: de saffier schijf wordt geplaatst op de platte kant van een “B” luchtvaartmaatschappij met de cellen die naar boven zijn gericht. Een gehakte “A” vervoerder met haar 0.1 mm diepte geconfronteerd met de cellen wordt geplaatst op de top te sluiten de “HPF sandwich”. De aluminium dragers en de patroon saffier schijven zijn commercieel verkrijgbaar (Zie Tabel van materialen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 5. FS Cryo-vaste cellen Opvullen van de FS-machine (Zie Tabel van materialen) met vloeibare stikstof. De temperatuur instellen tot-90 ° C en wacht tot de machine deze temperatuur bereikt. Bereiden van het medium van de FS met tetroxide (OsO4) osmium 0,2% (v/v), 0,1% uranyl acetaat (UA) (m/v) in glas-gedistilleerd aceton terwijl de FS-machine is afkoeling.Opmerking: Om voor te bereiden, mengen (bijvoorbeeld) 12 mL FS voedingsbodem, 600 µL van 4% OsO4met 0.012 g voor UA in een kleine glazen container. Los van dit mengsel in een ultrasoonbad apparaat voor 5 min. Voeg 11.4 mL aceton glas-gedistilleerd met een pipet en meng goed. Opvullen van 1,5 mL microcentrifuge buizen met 200-500 µL van FS medium, sluit het deksel en deze overbrengen naar de FS-machine. Wacht 10 minuten voor de FS-medium om af te koelen. Overdracht van de bevroren “broodjes” met de saffier schijven met cellen in vloeibare stikstof met behulp van gekoelde lange pincet de buizen met de FS-medium.Let op: Gebruik cryo-beschermende handschoenen en bril.Opmerking: De HPF “broodjes” kon worden gedemonteerd spontaan tijdens hun behandeling. In dit geval, ervoor te zorgen dat de bevroren saffieren schijven worden overgedragen aan de microcentrifuge-buizen. De aluminium dragers kunnen worden weggegooid. Loopt de FS als volgt tot de volgende dag27: van-90 ° C tot-80 ° C gedurende 8 uur; van-80 ° C tot-50 ° C gedurende 8 uur; van-50 ° C tot-20 ° C gedurende 2 uur; van-20 ° C tot 0 ° C gedurende 2 uur. 6. hars inbedding van Freeze vervangen monsters Let op: De hieronder beschreven procedures moeten worden uitgevoerd in een kabinet bioveiligheid. Bovendien zijn de meeste van de gebruikte reagentia gevaarlijke. Alvorens deze te gebruiken, is het verplicht om Lees aandachtig het materiaal veiligheidsinformatiebladen die door fabrikanten, evenals de veiligheidsverantwoordelijken vragen over de lokale regels om ervoor te zorgen veilig en gezond omgaan. Voor de juiste verwijdering van deze gebruikte materialen, alsook voor het juiste gebruik van de apparatuur die hieronder worden beschreven, is het ook vereist voor het raadplegen van het lokale Instituut gezondheids- en veiligheidsprocedures. Neem de gesubstitueerde specimens van de FS-machine en plaats ze op het ijs gedurende 20 minuten. Houd de monsters bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten en ze grondig te wassen (3 keer, 10 minuten elk) met glas-gedistilleerd aceton. Gooi de aluminium dragers met lange pincet als ze nog steeds in de buizen van de microcentrifuge na de FS zijn. Infiltreren cellen (in de resterende saffier schijven) in een reeks van vier stappen epoxy hars 1 h incubations met 25%, 50% en 75% hars in glas-gedistilleerd aceton, gevolgd door overnight incubatie met 100% hars. Wisselen de hars 100% de volgende dag voor 1 uur. Zorgvuldig plaatst de saffier schijven in doorstroomtest ringen gemonteerd in reagens baden gevuld met 100% hars. Deze ringen worden gebruikt als polymerisatie mallen voor 10 saffier schijven.Opmerking: De saffier schijven moeten worden helemaal geduwd naar de bodem met de coördinaten naar boven op een leesbare manier. Dit kan worden gecontroleerd met behulp van een verrekijker gekoppeld aan een rook-extractor. Anderzijds kan een verrekijker binnen een kabinet bioveiligheid in plaats daarvan worden gebruikt. Nog belangrijker is, zijn er nummers (1-10) gegraveerd op de bodem van de reagentia die helpen bij het identificeren van de monsters. Bovendien, voor de identificatie van de monsters kan een papieren label worden opgenomen in het blok hars. De monsters in de oven op 60 ° C gedurende 48 h polymeriseren. 7. de verwijdering van patroon Sapphire schijven uit de gepolymeriseerde hars blokken Verwijder de harde hars blokken met de cellen uit de oven.Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Zo niet, laat u de blokken afkoelen tot kamertemperatuur alvorens ze te snijden. Snijd de insluiten mallen met een scheermesje toegang hebben tot de hars blokken. Verwijder de cilindrische hars blokken met pincet.Opmerking: Als een papieren label is niet opgenomen de hars blokkeren voordat polymerisatie, nummer de blokken met een permanent marker en ze opslaan in 1,5 mL microcentrifuge buizen. Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Dompel het puntje van het blok van de hars bevat de saffier schijf in een polystyreen doos met vloeibare stikstof, totdat het stopt “borrelen”. Dan, dompel het puntje van het blok van de hars in kokend H2O. Herhaal de vorige twee stappen zo vaak als nodig totdat de saffier schijf af van het blok hars valt.Let op: Gebruik cryo-beschermende handschoenen en bril.Opmerking: Als dit niet werkt, gebruik een scheermesje te verwijderen van een bit van de gepolymeriseerde hars rond de schijven voordat u het opnieuw probeert. Het protocol kan hier worden gepauzeerd. 8. gerichte trimmen en uiterst dunne segmenteren voor TEM Identificeren van het gebied op het gezicht van de blok hars waar de cellen van belang door het onderzoek van het gezicht van het blok met de verrekijker van een ultramicrotome aanwezig zijn.Opmerking: Het negatieve stempel van het coördinaat patroon van de patroon saffier schijven behouden op het gezicht van het blok. Hierdoor is de identificatie van het gebied waar de cellen van belang zich bevinden voor gerichte trimmen. De LM-beelden moeten verticaal worden gespiegeld om te vergemakkelijken het vinden van dezelfde positie van het blok gezicht. Trim de ingesloten cel enkelgelaagde met de cel/cellen van belang zijn voor een kleine platte piramide met de vorm van een trapezium (~ 200 µm × 250 µm gemiddelde grootte) met een schone scheermesje. Verkrijgen 70-nm uiterst dunne secties van de ingesloten cellen met een mes van de diamant 35°. Plaats de secties op EM sleuf grids met behulp van ultra-fijne pincet.Opmerking:: het gebruik van mesh rasters moeten worden vermeden omdat de secties kunnen worden gemaskeerd door de tralies van het raster. Bewaar de rasters in een raster-vak.Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. 9. TEM analyse van uiterst dunne secties Plaats het rooster sleuf in de houder van de transmissie-elektronenmicroscoop. Verwerven van lage vergroting (overzicht) beelden, waar de volledige cel-Profiel van de cel van belang zichtbaar is.Opmerking:: de cel/cellen van belang vindt u terug via de cel-profielen en de locaties van de cellen aan elkaar als verwijzingen, vergelijken met de standpunten van de DIC vóór verworven door LM. Verwerven van hoge vergroting beelden van de cel/cellen van belang, om te proberen te vinden, op ultrastructureel niveau functies die overeenkomen met de fluorescerende signalen waargenomen eerder door LM.Opmerking: Montage beelden kunnen worden verkregen bij hoge vergroting een overzicht te hebben op hoge resolutie van de cel/cellen van belang. Bovendien is het vaak nodig om beelden van dezelfde cel in opeenvolgende seriële secties om de cel in 3D reconstrueren vóór te vergelijken met de beelden van de fluorescentie te kunnen verwerven.

Representative Results

Met behulp van de procedure die hier gepresenteerd (Figuur 1), Huh7-Lunet cellen stabiel uiten de T7-RNA-polymerase werden zaadjes op patroon saffieren schijven en vervolgens transfected met een plasmide uiten twee domeinen van het Hepatitis C-virus (HCV) nonstructural eiwit NS5A, gelabeld met GFP (pTM_AH-D1-GFP) (Figuur 4). De volgende dag, werden het patroon saffier schijven, waar de cellen groeiden, genomen uit de cel cultuur gerechten en beeld door middel van LM (Figuur 4, Figuur 2). Die cellen uiten van de AH-D1-GFP werden geïdentificeerd door de aanwezigheid van groene fluorescentie in het cytosol en geregistreerd om op te slaan hun posities binnen het coördinaat-patroon van de saffier schijven (cijfers 5A, 5B). Onmiddellijk na hun LM-onderzoek, de sapphire schijven met de cellen die van belang waren tussen twee aluminium dragers (Figuur 3) is geassembleerd en onderworpen aan cryo-immobilisatie door HPF. Cellen werden vervolgens blokkeert gesubstitueerde en vervolgens ingesloten in een epoxyhars. Na verwijdering van de saffier schijven uit de gepolymeriseerde hars blokken was de opdruk van de alfanumerieke patroon zichtbaar op het gezicht van het blok, waardoor het ophalen van de gebieden waar de cellen van belang gelegen waren. De rest van de hars blok was weg geknipt voor het genereren van een kleine trapezium herbergen van de cellen van belang. Seriële uiterst dunne secties verkregen is van deze trapezium, verzameld op EM sleuf rasters en verder geanalyseerd door TEM (Figuur 5C). Opmerking dat verkrijgen van handmatig seriële opeenvolgende secties, hoewel haalbaar28 is intensieve arbeid en goed opgeleide en geschoolde personeel vereist. Het is ook belangrijk dat de cellen een lage confluentie hebben wanneer onderworpen aan dit protocol CLEM (Figuur 5A) teneinde een snelle herkenning van dezelfde cel eerder aangeduid door LM. Anders, met hogere cel confluentie kan dramatisch vertragen de succesvolle lokaliseren van cellen op het niveau van de EM. TEM analyse van verschillende uiterst dunne secties van de cel van belang (cijfers 5D, 5E), de aanwezigheid in de intracellulaire ruimte van grote opeenhopingen van blaasjes van variabele morfologie gescheiden van uiting van de AH-D1-GFP, bleek de Omringende cytosol door een enkele lipide dubbelgelaagde (Figuur 5E). Figuur 4 : Schematische weergave van de werkstroom gevolgd voor het uitvoeren van het afgebeelde CLEM voorbeeld Figuur 5 . Huh7-Lunet cellen transfected stabiel uiten de T7-RNA-polymerase werden met een DNA plasmide codering de amphipathic helix (AH) en het domein 1 (D1) van de eiwitten van het HCV NS5A, tagged op de C-terminal met GFP (pTM_AH-D1-GFP). De uitdrukking van dit deel van het NS5A-eiwit wordt transcriptionally gecontroleerd door een T7 promotor (T7 Pm) en translationally door een encefalomyocarditis virus (EMCV) IRES (interne ribosome entry site) element, aangegeven door een secundaire structuur. Vierentwintig uur na transfectie (24 hpt) cellen groeien op patroon saffier schijven en uiten van de AH-D1-GFP werden gedetecteerd door LM en onmiddellijk onderworpen aan HPF-FS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5 : Voorbeeld van een procedure van CLEM. (A) Huh7-Lunet cellen stabiel uiten de T7 polymerase geanalyseerd door fluorescentie microscopie GFP-positieve cellen geteeld op patroon saffier schijven, 24 uur na de transfectie met de plasmide pTM_AH-D1-GFP toewijzen. (B) hogere vergroting afbeelding van een enkele cel binnen de witte onderbroken rechthoek geselecteerd om te worden geanalyseerd door CLEM. (C) TEM afbeelding van een uiterst dunne sectie van dezelfde cel na HPF, FS en hars inbedding. (D) schematische weergave van seriële 70-nm uiterst dunne secties op een grid van de sleuf EM met de cel van belang. (E) aan de linkerkant: TEM overzichten van twee secties van de cel van belang. Aan de rechterkant: hoge vergroting TEM beelden van de intracellulaire gebieden geselecteerd in gele rechthoeken aan de linkerkant, hoge aantal blaasjes gescheiden van het cytosol via een één membraan onthullen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De hier voorgestelde om te bestuderen van de impact van een virale eiwituitdrukking op celmembranen CLEM-methodologie is met succes gebruikt voordat om te verhelderen van het HCV replicatie-geassocieerde structuren, vooral dubbel membraan blaasjes (DMVs)²¹, alsook om te het bepalen van de kritische bouwstenen die nodig zijn om te vormen van deze structuren HCV-geïnduceerde²³. Merk op dat in onze eerste werk met behulp van CLEM te bestuderen van HCV replicatie²¹, een enigszins gewijzigde versie van het protocol hier beschreven werd toegepast. In die studie, conventionele 0,05 mm dik saffier schijven, zonder alfanumeriek patroon, werden gebruikt waarin een verwijzing patroon is gemaakt door carbon coating hen met een rooster van de finder op de top (Zie Tabel van materialen). Deze versie van het huidige protocol kan uiteindelijk worden toegepast, met het voordeel dat de “A” vervoerder voor HPF rechtstreeks, zonder de noodzaak voor het kappen zoals in Figuur 3Akan worden gebruikt. Als alternatief, zoals vermeld in het protocol, een dikkere “A” vervoerder kan worden gebruikt (Zie Tabel van materialen) met gedessineerde saffier schijven, zonder de behoefte aan een “B” luchtvaartmaatschappij.

Interessant, kan dit protocol worden toegepast, niet alleen om te studeren van BSL-1 monsters, zoals cellen transfected met virale eiwitten zoals beschreven hier en elders¹⁹^,²³, maar ook aan de studie van virus-geïnfecteerde cellen. Hoewel werken met menselijke pathogenen meestal beperkt tot BSL-2 en3 BSL laboratoria is, in sommige landen is het nog steeds mogelijk om uit te voeren cryo-immobilisatie onder deze omstandigheden inzake bioveiligheid. In die BSL-2 en de BSL-3 laboratoria waar verglazing niet mogelijk, als gevolg van de plaatselijke regelgeving of het ontbreken van een machine HPF is, kunnen virus-geïnfecteerde cellen nog steeds bereid worden met behulp van deze methode als chemische fixatie met aldehyden van tevoren, wordt uitgevoerd namelijk verlaten voordat de BSL-2 of BSL-3 faciliteiten. Bovendien dienen aldehyden te worden uitgeblust onmiddellijk na fixatie te houden van de fluorescentie, terwijl de rest van het protocol identiek aan de hier beschreven is. Deze techniek kan worden beschouwd als overbodig omdat de cellen zijn vaste tweemaal, chemisch en via verglazing. Dit protocol dubbele fixatie leidt echter inderdaad tot een veel beter behoud van de HCV-geïnduceerde DMVs in vergelijking met de DMVs gevonden in cellen die zijn blootgesteld aan chemische fixatie alleen²¹.

Voor verdere wijzigingen en het oplossen van problemen met de lezer wordt verwezen naar de toelichting in het protocol deel van dit manuscript. Deze nota’s beschrijven valkuilen te vermijden, evenals alternatieven voor vermeende problemen die zich voordoen kunnen bij het uitvoeren van deze methode.

De belangrijkste voorwaarde voor het toepassen van deze techniek is een HPF machine. Wanneer de cellen via HPF is niet haalbaar (als gevolg van het ontbreken van een machine HPF) of niet verplicht is (wanneer het membraan behoud hoeft niet te worden optimaal), cryo immobilizing cellen kan worden chemisch vaste en vervolgens voorbereid en geanalyseerd door EM⁸^, ⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ ^,¹⁹. Deze optie hoeft niet het gebruik van sapphire schijven, maar cel cultuur gerechten met gerasterde patronen voor het verplaatsen van cellen of cel clusters. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze gerechten is hun grotere diameter in vergelijking met saffier schijven, waardoor de screening van grotere oppervlaktes. Dus, de toepassing van dit protocol CLEM is met succes toegepast te bestuderen van het effect van een antivirale samengestelde tegen HCV¹⁵ of te visualiseren de membraan herschikkingen geïnduceerd door de nonstructural eiwitten van norovirussen¹⁹. Een andere kwestie die de prestaties van deze methode beperken kan is het ontbreken van een commerciële FS-apparaat. Basissystemen zelfgemaakte FS kunnen in dit geval in plaats daarvan worden gebruikt. Hoewel automatische FS apparaten behandeling ongelukken verminderen kunnen, worden zelfgemaakte apparaten gebruikt met succes bijvoorbeeld bij Kent McDonald’s³⁰ en Paul Walther de labs.

Met betrekking tot chemische fixatie, het protocol beschreven hier zorgt voor een optimaal behoud van de intracellulaire structuren²⁰. Daarom, in het geval dat de bovengenoemde HPF en FS apparaten beschikbaar zijn, de cellen van belang vitrifying zou de voorkeur.

Toekomstige alternatieven voor deze aanpak CLEM omvatten de mogelijkheid van het gebruik van deze methode niet alleen om 2D informatie op ultrastructureel niveau te verwerven, maar ook om te krijgen 3D-informatie over de architectuur van membraan en organel wijzigingen veroorzaakt door virussen. De 3D-EM-methoden, met inbegrip van Elektronentomografie (ET) en gerichte ion beam-scanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM) (uitgebreid beschreven in²⁹), kunnen ook worden toegepast op cellen die zijn opgesteld na deze huidige protocol²¹^, ³¹. Daarnaast kon 3D-informatie worden ook verkregen op het niveau van de LM, bij het gebruik van een confocal microscoop, waarmee de verwerving van z-stacks. Deze optie wordt echter nadrukkelijk aanbevolen wanneer een precieze correlatie tussen LM en EM datasets is gewenste (zie bijvoorbeeld¹⁷). De informatie opgenomen in 3D z-stacks aids ter verbetering van de correlatie met de 2D TEM beelden. Dus, in zulk een scenario, de best passende LM en EM afbeeldingen kunnen worden geselecteerd en vervolgens onderworpen aan een van de correlatie software beschikbaar, zoals de EG-CLEM plugin van ICY (http://icy.bioimageanalysis.org/)³² of de Landmark correspondenties plugin van Afbeelding J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), resulterend in de generatie van overlappende LM-EM beelden.

Wanneer temporele informatie is nodig om te begrijpen van de kinetiek van een bepaalde gebeurtenis, kan time-lapse beeldvorming worden gebruikt om te controleren van de dynamiek van levende cellen in combinatie met EM. Tijdens het evenement van belang, cellen vastliggen onmiddellijk, het genereren van een “bevroren momentopname” die later kan worden geanalyseerd via EM, gedetailleerde ultrastructurele voorlichting over dat moment op het moment van immobilisatie. Het verkrijgen van die “bevroren momentopname”, na de observatie in real-time, kunnen cellen chemisch vaste³³ of cryo-geïmmobiliseerd⁶. Aangezien veel cellulaire processen er sneller dan de processen van de verspreiding van chemische fixatie voorkomen, indien mogelijk, moet Ultra snelle invriezen worden uitgevoerd. Het is echter belangrijk om rekening te houden dat de HPF machines in hun effectieve tijd resolutie³⁴verschillen.

Bovendien, hoewel dit protocol is ontworpen voor het insluiten van cellen in een epoxyhars, cellen kunnen worden ook ingebed in lage viscositeit harsen, zoals Lowicryls, LR wit of LR goud. Het gebruik van deze insluiten media stelt voor het behoud van de antigenicity³⁵^,³⁶, evenals de fluorescentie³⁷^,³⁸ en daarom worden meestal gebruikt voor het insluiten van post op-sectie immunolabeling³⁹ ^, ⁴⁰ en op-sectie CLEM⁴¹^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴, waar de LM wordt gedaan na de insluiten. Beide benaderingen (immuno-EM en op-sectie CLEM) moeten worden cruciaal voor die experimenten in die niet-karakteristieke structuren kunnen gemakkelijk worden gevonden via TEM en/of als een besturingselement tegen miscorrelation tussen LM en EM signalen. Ook labelen met antilichamen die kunnen worden gevisualiseerd door beide beeldvormende modaliteiten (LM en EM) kan worden uitgevoerd⁴⁵ om, bijvoorbeeld, het identificeren van transfected cellen in LM (vooraf insluiten fase) en bereiken een veel nauwkeurigere lokalisatie van de GFP signaal via haar specifieke etikettering door immuno-EM (post inbedden fase). Er moet rekening worden gehouden, echter, dat permeabilization wordt uitgevoerd voordat LM voor de toegang tot van de antilichamen tegen de intracellulaire ruimte, die in een suboptimale behoud van de architectuur van de cel op het niveau van de EM resulteren kan. Interessant is dat dit protocol is ook geschikt voor Multi-Color die experimenten met het gebruik van andere fluorescerende tags, dan GFP kan worden bereikt (zoals hier). Kortom, zijn er vele putatief mogelijkheden van aanpassing van dit protocol, zowel op de LM en/of op de zijkanten van de EM, afhankelijk van de vragen die worden aangepakt. Voor een uitgebreide beschrijving van andere alternatieve protocollen wordt de lezer verwezen naar⁵^,⁴⁶. Ongeacht hoe de microscopie modaliteiten worden gecombineerd, is het resultaat samen een winst van informatie, zodat we beter begrijpen hoe virussen en hun eiwitten interactie met hun legers in het echte leven.

De meest kritische stap binnen deze methode is de verzameling van seriële secties uit de cellen van belang. Zoals benadrukt in de sectie representatieve resultaten vereist dit deskundige medewerkers, evenals veel geduld. Nog belangrijker is, is deze stap is essentieel om te vinden de cellen terug op het niveau van de EM om twee redenen. Ten eerste, in dit soort CLEM protocol gebruikt vooraf te embedding LM, de coördinaten zijn alleen zichtbaar op de LM-niveau en op het gezicht van de blok hars na de insluiten. Echter, zij zal niet zichtbaar zijn op de trajecten door TEM. Gerichte trimmen op het blok naar beneden naar de regio’s van belang (ROIs) moet daarom zorgvuldig worden uitgevoerd met een scheermesje om ervoor te zorgen dat de secties die vervolgens worden verkregen de cellen worden, uiting geven aan een bepaalde FP. Ten tweede is het noodzakelijk te vinden van de beste overlay tussen de LM en de overnames van EM “scannen” verschillende secties. In tegenstelling tot methoden waar LM in de post te embedding stadium wordt uitgevoerd, is in dit geval de LM-EM-overlay niet zo nauwkeurig. De lage overlay nauwkeurigheid is te wijten aan verschillen in axiale resolutie tussen LM en EM, krimp tijdens de verwerking van de steekproef van EM, en tijdens het segmenteren van⁴²gecomprimeerd. Toch helpen efficiënt bijhouden methoden, zoals het gebruik van bezienswaardigheden, de cellen terug te vinden. Het gaat hierbij om de positie van één cel naar de andere, evenals de vorm van de cellen en hun kern. In dit opzicht zoals uiteengezet in het protocol, geven DIC-afbeeldingen “anatomische” informatie van de cellen die essentieel zijn voor het verbeteren van de correlatie. Als alternatief, de kernen of andere organellen goed herkenbare cel (zoals mitochondriën of lipide druppels) kunnen worden gekleurd voor LM en gebruikt als monumenten.

Tot slot is het opmerkelijk te noemen dat hoewel dit manuscript is gericht op het gebruik van deze techniek voor Virologie studies, het toepassingsgebied van deze proefopzet kan worden uitgebreid om aan te pakken van de meer algemene vragen van de biologische.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn zeer dankbaar aan de personeelsleden van het elektronenmicroscopie Core voorzieningen (EFMS) op EMBL (Heidelberg) en aan de Universiteit van Heidelberg. Wij ook bedank Ulrike Herian, Stephanie Kallis en Andrea Hellwig (Universiteit van Heidelberg), evenals Eberhardt Schmidt en Renate Kunz (Universiteit van Ulm) voor deskundige technische bijstand. Werk van R.B. en zijn team (U.H. en IR-B.) werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 en TRR83, TP13.

Materials

UV Crosslinker	Stratagene	400072	Stratalinker 1800, 230Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8-watts/each.
Patterned sapphire discs	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	627	They have a 0.3-mm diameter and are 0.16-mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Slim and long tweezers	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	72919-SS	"Style SS", for handling sapphire discs.
Cell culture medium	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	41965-062	Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 µg streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 ml/each.
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	25030-123	Package containing 20 bottles of 100 ml/each.
Nonessential amino acids	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11140-068	Package containing 20 bottles of 100 ml/each.
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15140-163	Package containing 20 bottles of 100 ml/each.
Fetal calf serum	Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA	F7524	Bottle of 50 ml.
Inverted microscope	Olympus Deutschland, Hamburg, Germany	CKX41	It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability.
Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase	Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory	Not available	Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.
Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent	Mirus Bio LLC, Madison, USA	MIR 2304	Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 ml.
Inverted widefield fluorescence microscope	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany	Zeiss Observer.Z1	Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures.
1-hexadecene	Merck, Darmstadt, Germany	8220640100	Bottle of 100 ml.
"A" aluminium holders for high pressure frezing (HPF)	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	241	This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2-mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
"B" aluminium holders for HPF	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	242	This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3-mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
"A" aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs)	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	737	This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a "B" holder or the edition of the "A" holder. It is 0.84-mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Sapphire discs	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	405	These sapphires discs are the "conventional" one, with a 0.3-mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs.
Finder grids	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA	LF135-Cu	These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on "conventional" sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial.
HPF machine	ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland	HPM 01	This HPF machine has been used for this protocol.
HPF machine	Leica Microsystems, Vienna, Austria	EMPACT 2	"EMPACT 2", as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above).
Cryo-tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Z763667-500EA	For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials.
Liquid nitrogen dewar	Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany	GZ-05094-60	For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes.
Automatic freeze substitution (AFS) machine	Leica Microsystems, Vienna, Austria	EM AFS2	This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins.
Osmium tetroxide (OsO4)	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	19150	4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 ml ampules.
Uranyl-Acetate (UA)	Serva, Heidelberg, Germany	77879.01	Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O.
Sonicator	Bandelin Electronic, Berlin, Germany	329	"Sonorex Super RK 31" is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium.
Glass-distilled acetone	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	10015	Bottle of 100 ml.
Stereomicroscope	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica M80	Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images.
Epoxy resin	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	14120	Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers.
Flow through rings	Leica Microsystems, Vienna, Austria	16707157	Package containing 100 pieces.
Reagent baths	Leica Microsystems, Vienna, Austria	16707154	Package containing 100 pieces.
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica EM UC7	Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature.
Ultra 35° diamond knife	Diatome Ltd., Nidau Switzerland	AGG339-735	This knife have an edge length of 3 mm.
Ultra fine tweezers	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	E78318	"Style 3X", for handling EM grids.
EM slot grids	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	G2010-Cu	100 grids/vial.
EM grid storage box	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	71155	It has capacity for 100 grids.

Referenzen

Morgan, C., Godman, G. C., Breitenfeld, P. M., Rose, H. M. A correlative study by electron and light microscopy of the development of type 5 adenovirus. I. Electron microscopy. Journal of Experimental Medicine. 112, 373-382 (1960).
Godman, G. C., Morgan, C., Breitenfeld, P. M., Rose, H. M. A correlative study by electron and light microscopy of the development of type 5 adenovirus. II. Light microscopy. Journal of Experimental Medicine. 112, 383-402 (1960).
Caplan, J., Niethammer, M., Taylor, R. M., Czymmek, K. J. The power of correlative microscopy: multi-modal, multi-scale, multi-dimensional. Current Opinion in Structural Biology. 21, 686-693 (2011).
de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nature Methods. 12, 503-513 (2015).
Müller-Reichert, T., Verkade, P. . Correlative light and electron microscopy III, First edition. , (2017).
Brown, E., Mantell, J., Carter, D., Tilly, G., Verkade, P. Studying intracellular transport using high-pressure freezing and Correlative Light Electron Microscopy. Seminars in Cell and Developmental Biology. 20, 910-919 (2009).
Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A., Bartenschlager, R. Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions. FEBS Letters. , (2016).
Spuul, P., et al. Assembly of alphavirus replication complexes from RNA and protein components in a novel trans-replication system in mammalian cells. Journal of Virology. 85, 4739-4751 (2011).
Nagel, C. H., Dohner, K., Binz, A., Bauerfeind, R., Sodeik, B. Improper tagging of the non-essential small capsid protein VP26 impairs nuclear capsid egress of herpes simplex virus. PLoS One. 7, 44177 (2012).
Sharma, M., Kamil, J. P., Coughlin, M., Reim, N. I., Coen, D. M. Human cytomegalovirus UL50 and UL53 recruit viral protein kinase UL97, not protein kinase C, for disruption of nuclear lamina and nuclear egress in infected cells. Journal of Virology. 88, 249-262 (2014).
Kallio, K., et al. Template RNA length determines the size of replication complex spherules for Semliki Forest virus. Journal of Virology. 87, 9125-9134 (2013).
Martinez, M. G., Snapp, E. L., Perumal, G. S., Macaluso, F. P., Kielian, M. Imaging the alphavirus exit pathway. Journal of Virology. 88, 6922-6933 (2014).
Lebrun, M., et al. Varicella-zoster virus induces the formation of dynamic nuclear capsid aggregates. Virology. 454-455, 311-327 (2014).
Madela, K., et al. A simple procedure to analyze positions of interest in infectious cell cultures by correlative light and electron microscopy. Methods in Cell Biology. 124, 93-110 (2014).
Berger, C., et al. Daclatasvir-like inhibitors of NS5A block early biogenesis of hepatitis C virus-induced membranous replication factories, independent of RNA replication. Gastroenterology. 147, 1094-1105 (2014).
van der Schaar, H. M., et al. Illuminating the Sites of Enterovirus Replication in Living Cells by Using a Split-GFP-Tagged Viral Protein. mSphere. 1, (2016).
Vale-Costa, S., et al. Influenza A virus ribonucleoproteins modulate host recycling by competing with Rab11 effectors. Journal of Cell Science. 129, 1697-1710 (2016).
Wang, L., et al. Visualization of HIV T Cell Virological Synapses and Virus-Containing Compartments by Three-Dimensional Correlative Light and Electron Microscopy. Journal of Virology. 91, (2017).
Doerflinger, S. Y., et al. Membrane alterations induced by nonstructural proteins of human norovirus. PLOS Pathogens. 13, 1006705 (2017).
Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
Romero-Brey, I., et al. Three-dimensional architecture and biogenesis of membrane structures associated with hepatitis C virus replication. PLOS Pathogens. 8, 1003056 (2012).
Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
Romero-Brey, I., et al. NS5A Domain 1 and Polyprotein Cleavage Kinetics Are Critical for Induction of Double-Membrane Vesicles Associated with Hepatitis C Virus Replication. MBio. 6, 00759 (2015).
Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36, 280-290 (2003).
Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1011, 45-56 (2004).
McDonald, K. L., Morphew, M., Verkade, P., Muller-Reichert, T. Recent advances in high-pressure freezing: equipment- and specimen-loading methods. Methods in Molecular Biology. 369, 143-173 (2007).
Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: the visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208, 3-10 (2002).
White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314, 1-340 (1986).
Romero-Brey, I., Bartenschlager, R. Viral Infection at High Magnification: 3D Electron Microscopy Methods to Analyze the Architecture of Infected Cells. Viruses. 7, 6316-6345 (2015).
McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
Villinger, C., Neusser, G., Kranz, C., Walther, P., Mertens, T. 3D Analysis of HCMV Induced-Nuclear Membrane Structures by FIB/SEM Tomography: Insight into an Unprecedented Membrane Morphology. Viruses. 7, 5686-5704 (2015).
Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nature Methods. 14, 102-103 (2017).
Polishchuk, R. S., Mironov, A. A. Correlative video light/electron microscopy. Current Protocols in Cell Biology Supplement. , 8 (2001).
McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of Microscopy. 235, 273-281 (2009).
Newman, G. R., Jasani, B., Williams, E. D. A simple post-embedding system for the rapid demonstration of tissue antigens under the electron microscope. The Histochemical Journal. 15, 543-555 (1983).
Schwarz, H., Humbel, B. M. Influence of fixatives and embedding media on immunolabelling of freeze-substituted cells. Scanning Microscopy. 3, 57-63 (1989).
Luby-Phelps, K., Ning, G., Fogerty, J., Besharse, J. C. Visualization of identified GFP-expressing cells by light and electron microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 51, 271-274 (2003).
Nixon, S. J., et al. A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos. Traffic. 10, 131-136 (2009).
McDonald, K. L. Rapid embedding methods into epoxy and LR White resins for morphological and immunological analysis of cryofixed biological specimens. Microscopy and Microanalysis. 20, 152-163 (2014).
Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods in Cell Biology. 88, 45-58 (2008).
Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. Journal of Cell Biology. 192, 111-119 (2011).
Peddie, C. J., et al. Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells. Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).
Hampoelz, B., et al. Pre-assembled Nuclear Pores Insert into the Nuclear Envelope during Early Development. Cell. 166, 664-678 (2016).
Lemercier, N., et al. Microtome-integrated microscope system for high sensitivity tracking of in-resin fluorescence in blocks and ultrathin sections for correlative microscopy. Scientific Reports. 7, 13583 (2017).
Takizawa, T., Powell, R. D., Hainfeld, J. F., Robinson, J. M. FluoroNanogold: an important probe for correlative microscopy. Journal of Biological Chemistry. 8, 129-142 (2015).
Romero-Brey, I., Yamauchi, Y. 3D electron microscopy (EM) and correlative light electron microscopy (CLEM) methods to study virus-host interactions. Methods in Molecular Biology: Influenza Virus Methods & Protocols. , (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Diesen Artikel zitieren

Santarella-Mellwig, R., Haselmann, U., Schieber, N. L., Walther, P., Schwab, Y., Antony, C., Bartenschlager, R., Romero-Brey, I. Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells. J. Vis. Exp. (139), e58154, doi:10.3791/58154 (2018).