低温固定化细胞跟踪和成像病毒蛋白相关结构的相关光电子显微镜 (克莱)

1. 用于细胞培养的图案蓝宝石圆盘的制备 将图案的蓝宝石圆盘 (见材料表), 用一个字母数字图案刻在其表面上, 变成15毫升锥形离心管。注: 或者, 传统的0.05 毫米厚蓝宝石光盘没有字母数字模式可以使用, 其中一个参考模式是由碳涂层他们与 finder 网格在顶部。为了达到这个目的, 在应用碳模式之前, 应该用乙醇清洗。 用乙醇彻底清洗。用过滤纸把它们分散在培养皿里, 让它们干。把它们放在玻璃滑梯上, 用纤细的长镊子隔开。 检查与倒置显微镜 (4X 放大) 是否在每个蓝宝石光盘上的坐标模式是可读的。注: 如果情况并非如此, 请在镊子的帮助下翻转蓝宝石光盘。 将蓝宝石光盘存储在培养皿中。注意: 协议可以在这里暂停。 2. 带图案蓝宝石圆盘的细胞培养 用紫外线 (UV) 交联剂对图案蓝宝石光盘进行消毒5分钟。 把蓝宝石光盘带到细胞培养生物安全柜。在生物安全柜中用乙醇消毒长镊子。 将细胞培养基的一半 (见材料表) 添加到细胞培养皿中。用长镊子小心地将蓝宝石盘转移到细胞培养皿中。 种子 1 x 105 Huh7-Lunet 细胞, 稳定地表达 T7 聚合酶悬浮在细胞培养培养基的另一半, 上培养皿。注: 计算要播种的细胞数, 在实验的终点, 细胞融合不应超过20–30%。高细胞密度会阻碍细胞在后期被 EM 迁移。此外, 过度融合可能导致细胞脱离蓝宝石圆盘。 检查蓝宝石光盘是否留在培养基的底部, 字母数字坐标仍然可读与倒置显微镜。注意: 如果光盘漂浮在细胞培养基中, 使用长镊子将光盘推到底部, 最终将其翻转回正确的方向。 染第二天的单元格, 如先前在参照21,23中报告了转染代理制造商的指示。 3. 在图案蓝宝石圆盘上生长细胞的 LM 成像 在实验结束点将蓝宝石圆盘转移到含有30–50µL/pH 无指示介质位置的金属成像板, 以减少非特异性背景荧光。注: 此处描述的金属板 (图 2) 已在欧洲分子生物学实验室 (EMBL) 车间设计。如果没有这个板块或类似的, 玻璃底部细胞培养皿也可以使用, 而不是 LM。在无 pH 指标的培养基中改变正常细胞培养基是很重要的。还要注意, 长时间暴露时间应该避免, 因为它们可能导致漂白, 导致活性氧 (ROS) 积累和细胞的生理损伤24,25。 在倒置的 widefield 荧光显微镜下对细胞进行成像。注: 使用绿色荧光蛋白 (GFP) 标记的蛋白质时, 如代表结果所示, 应使用 450–490 nm 和500–550纳米激发和发射过滤器。 首先获取单元格的低放大图像 (10–20X), 以分配表达 FPs 的单元格. 用差分干涉对比显微镜记录感兴趣细胞所在的图案蓝宝石圆盘的坐标。注意: 缝合几个区域可能有助于更好地了解感兴趣的细胞/细胞的位置。还请注意, 相对比显微镜可以选择在这里使用。 获取相同细胞/细胞的高放大率 (荧光和 DIC) 图像 (63–100X, 油浸泡目标), 以更好地辨别细胞内的蛋白质在胞内空间的定位。注意: DIC 图像提供上下文信息。这些信息通常是至关重要的, 以关联 LM 图像与 EM 显微照片后, 因为最终的相关性更精确的 “解剖” 地标的细胞。由于一些蓝宝石光盘可能会打破在冷冻固定, 它是强烈建议准备 triplicates 每一个条件。此外, 有些细胞在 HPF 过程中与光盘分离, 而其他细胞的超微结构可能会由于冰冻损伤而包含工件。因此, 至少有两个区域的光盘应该通过 LM 映像, 以确保最终将有足够的细胞进行分析。重要的是, 这两个区域应该在光盘的反面。在这种方式下, 细胞嵌入的树脂块可以被切成两半, 这些区域的部分可以得到。 图 2: 用于在图案蓝宝石光盘上生长的细胞的 LM 成像模式。(A)蓝宝石圆盘是用细镊子的帮助转移到成像板上的。(B)这个板块是专门设计在海德堡的 EMBL 车间, 以适应光显微镜, 其中蓝宝石光盘可以成像与细胞培养基没有 pH 值指示器。它由一个金属滑动, 75 毫米 x 25 毫米 x 1 毫米, 与4/5 孔铣入它与3毫米钻头适合蓝宝石盘的大小。另外, 小凹槽在孔的每边在90°角度被碾磨。这些孔使使用镊子在操作时更容易进入光盘。为使最佳成像条件, 玻璃盖玻片 0 (0.085 至0.13 毫米厚) 被粘在孔下面的 uv 胶水和放置在紫外线下硬化。(D)图案蓝宝石圆盘的高放大图像, 描绘了刻在其表面上的字母数字坐标。图案化的蓝宝石光盘可供商业使用 (见材料表)。请单击此处查看此图的较大版本. 4. 通过 HPF 在图案蓝宝石圆盘上生长的细胞的低温固定化 放置 “A” 和 “B” 铝载体为 HPF (参见材料表) 在培养皿与过滤纸浸泡与 1-hexadecene。浸入含有 1 hexadecene 的培养皿中包含细胞的图案蓝宝石圆盘。注意: 移动光盘, 以洗涤细胞培养基远离。 在 HPF 持有者的 “A” 和 “B” 铝载体之间组装蓝宝石光盘, 如下所示 (图 3B)。在底部, 放置一个 “B” 承运人, 其平面面朝上向上。将蓝宝石光盘放在这个平坦的一侧, 单元格朝上。添加一个 “A” 载体, 其0.1 毫米的深度面对细胞。注: 由于图案蓝宝石光盘比传统蓝宝石光盘厚, 商用 “A” 载体 (设计用于与非图案0.05 毫米蓝宝石光盘) 必须削减到0.05 毫米在这0.2 毫米深度一侧在 EMBL车间, 以适应 HPF 持有人 (图 3A)。为此目的 , A 载体入到金属管的末端 , 以便它的 0 . 2 毫米边被暴露并且仍然保持 , 当削减它时。切割的一侧, 然后打磨, 使它是平坦的。另外, 一个特殊的铝载体可以使用在图案的蓝宝石光盘上 (商业上可用, 见材料表), 在这种情况下, HPF “三明治” 只组成蓝宝石光盘和这个载体。 关闭 HPF 机的支架并冻结单元格。注意: 此协议特定于特定的 HPF 计算机。其他 HPF 机器可以交替地使用6,26。在任何情况下, 请注意来自供应商的新一代机器的存在。注意: 使用安全护目镜和听觉保护耳机。 将冷冻的 “三明治” 放在带有液氮的聚苯乙烯盒中, 用于临时贮存。注意: 使用护目镜, 并与当地安全官员接触, 了解在处理液氮时的潜在危险。 为了避免混淆, 将每个 “三明治” 放在一个单独的0.5 毫升离心管 (在聚苯乙烯盒内), 标有一个数字。注意: 协议可以在这里暂停。如果不能立即执行冻结替代 (FS), 则可以将样品存储在箱内的低温管 (在顶部打孔) 内, 这些容器在低温液氮杜瓦瓶中的机架中 (见材料表)。这个液氮容器应该位于一个有氧气体传感器的房间里, 以防缺氧时窒息。注意: 下面所述的所有程序 (步骤5和 6) 必须在生物安全柜中进行。此外, 大多数使用的试剂是危险的。在使用之前, 必须仔细阅读制造商提供的材料安全数据表, 并向安全官员询问当地的规则, 以确保安全处理。为正确处置这些二手材料, 以及正确使用以下所述设备, 还需要咨询当地研究所的卫生和安全程序。 图 3: HPF 两个铝载体之间的图案蓝宝石圆盘组装模式。(a)传统的 “A” 载体的切割视图, 必须从0.2 毫米到0.05 毫米的更深一侧切割. (B) 0.16 毫米厚蓝宝石光盘, 其表面蚀刻的字母数字图案被组装成两个铝载体 HPF, 如下所示: 蓝宝石圆盘放置在 “B” 载体的平边上, 单元格朝向向上。一个切碎的 “A” 载体, 其0.1 毫米的深度面对细胞被放置在顶部关闭 “HPF 三明治”。铝载体和被图案的蓝宝石盘是商业上可利用的 (参见材料表)。请单击此处查看此图的较大版本. 5. 冷冻固定细胞的 FS 用液氮填满 FS 机 (见材料表)。将温度设置为-90 摄氏度, 等待机器达到此温度。 用玻璃蒸馏丙酮制备含0.2% 锇毒气 (OsO4) (v/v)、0.1% 醋酸铀 (UA) 的 fs 介质, 而 fs 机则冷却。注: 准备, (例如) 12 毫升的 FS 介质, 混合600µL 4% OsO4与0.012 克的 UA 在一个小的玻璃容器。将这种混合物在超声波浴装置中溶解5分钟. 用吸管加入11.4 毫升的玻璃蒸馏丙酮, 混合均匀。 填充1.5 毫升离心管与200-500 µL 的 fs 介质, 关闭盖子, 并将其转移到 FS 机器。等待10分钟的 FS 介质冷却。 将含有蓝宝石圆盘的冰冻 “三明治” 转移到含有 FS 介质的管中, 用冷却的长镊子将其与液态氮气中的细胞结合使用。注意: 使用低温防护手套和护目镜。注: HPF “三明治” 可以在处理过程中自发分解。在这种情况下, 确保冻结蓝宝石光盘转移到离心管。铝载体可以被丢弃。 运行 FS 如下, 直到第二天27: 从-90 °c 到-80 °c 为 8 h;从-80 °c 到-50 °c 为 8 h;从-50 °c 到-20 °c 为 2 h;从-20 °c 到0°c 为 2 h。 6. 冷冻替代样品的树脂嵌入 注意: 下面描述的所有程序必须在生物安全柜中进行。此外, 大多数使用的试剂是危险的。在使用之前, 必须仔细阅读制造商提供的材料安全数据表, 并向安全官员询问当地的规则, 以确保安全处理。为正确处置这些二手材料, 以及正确使用以下所述设备, 还需要咨询当地研究所的卫生和安全程序。 取出 FS 机器上的替代样品, 放在冰上20分钟。 将样品常温保存20分钟, 用玻璃蒸馏丙酮彻底清洗 (3 次, 每10分钟)。如果在 FS 后仍在离心管中, 用长镊子丢弃铝载体。 用 1 h 孵化在25%、50% 和75% 树脂中的四步环氧树脂系列中渗透细胞 (在剩余的蓝宝石圆盘上), 然后用100% 树脂进行隔夜孵化。第二天将100% 树脂换成1h。 小心地将蓝宝石圆盘放入装有100% 树脂的试剂浴中的流动环中。这些环被用作10蓝宝石圆盘的聚合模。注: 蓝宝石光盘必须完全推到底部, 坐标朝上以可读的方式向上。这可以用一双双目连接到抽油烟机的帮助下进行检查。另外, 可以使用生物安全柜内的双目。重要的是, 有数字 (1-10) 刻在试剂的底部, 有助于识别样品。 另外, 为样品的证明一个纸标记可以包括在树脂块。 聚合在烤箱中的样品在60°c 为48小时。 7. 从聚合树脂块中去除图案蓝宝石圆盘 从烤箱中取出含有电池的硬树脂块。注意: 协议可以在这里暂停。如果不这样做, 在切割之前, 让这些块冷却到室温。 用剃刀刀片切割嵌入模具, 以获得树脂块。使用镊子拆卸圆柱形树脂块。注: 如果在聚合前未将纸标签包括在树脂块中, 则用永久性标记将这些块编号, 并将其存储在1.5 毫升离心管中。协议可以在这里暂停。 将含有蓝宝石圆盘的树脂块的尖端浸入含有液氮的聚苯乙烯盒中, 直到它停止 “冒泡”。然后, 将树脂块的尖端浸入沸腾的 H2O。 重复上述两个步骤, 尽可能多次, 直到蓝宝石光盘脱落的树脂块。注意: 使用护目镜和低温防护手套。注: 如果此操作不起作用, 请使用剃刀刀片在光盘周围移去一点聚合树脂, 然后再试一次。协议可以在这里暂停。 8. 透射电镜靶向修整和超薄切片 用 ultramicrotome 的双目检查块面, 在树脂块面上识别出感兴趣的细胞所在的区域。注: 图案蓝宝石圆盘上的坐标图案的负压印保留在块面上。这允许标识感兴趣的单元格所在的区域以进行目标修剪。LM 图像必须垂直翻转, 以方便查找同一位置的块面。 将含有所感兴趣的细胞/细胞的嵌入细胞单层修剪成一个具有梯形 (约200µm x 250 µm 平均尺寸) 的小型扁平金字塔, 并配以干净的刀片。 用35°金刚石刀获得嵌入细胞的70纳米超薄截面。 使用超细镊子将部分放在 EM 插槽网格上。注:应避免使用网状网格, 因为网格栏可以屏蔽部分。 将网格存储在网格框中。注意: 协议可以在这里暂停。 9. 超薄断面的 TEM 分析 将插槽网格放入透射电镜的持有者。获取低放大率 (概述) 图像, 其中所感兴趣单元格的完整单元格配置文件可见。注::通过使用单元格配置文件和单元格的位置作为参考, 与 LM 之前获取的 DIC 视图进行比较, 可以找到感兴趣的单元格/单元格。 获取高放大图像的细胞/细胞的兴趣, 尝试和发现, 在超微结构水平上的特点, 对应的荧光信号, 以前观察到 LM。注: 蒙太奇图像可以获得在高放大率有一个全面的分辨率细胞/细胞的兴趣。此外, 在与荧光图像进行比较之前, 通常需要在连续的序列切片中获取同一个细胞的图像, 以便能够在3D 重建细胞。