分離とクラミドモナス由来の単一粒子再構成のための蛍光イメージング

1. C. クラミドモナスの文化の中心小体分離メディアの準備 C. クラミドモナス細胞培養するメディアの準備注: 以下の手順は、1 タップ (リン酸トリス酢酸) 中 x ストック溶液の調製をについて説明します。 1 M KH2PO4 (KH2PO4 1 L 136.09 g) ~ 170 mL で 1 M K2HPO4 (K2HPO4蒸留水 1 L に混じって 174.2 g) 250 mL を混合することによってリン酸バッファー (pH 7) を準備します。PH 7 に到達する混合気を調整します。 トリスの 96.8 グラム、40 mL のリン酸バッファー (pH 7)、酢酸 40 mL を混合することによってソリューション (40 x) を準備し、蒸留水 1 L にソリューションを調整します。 ソリューション B の準備 (40 x) NH4Cl の 16 g、CaCl2, 2 g と MgSO4の 4 g を使用しています。その他のコンポーネントを追加する前に個別に CaCl2蒸留水を溶解する注意してください。蒸留水 1 L にソリューションを調整します。 とおり25 Hutner のトレース要素のバッファーを準備します。 バッファーの 1 L の溶解水の示された量の各化合物: EDTA 二ナトリウム塩 (250 mL に 50 g)、ZnSO4.7H2O (100 mL で 22 g) H3ボー3 (200 mL で 11.4 g)、MnCl2.4H2O (50 mL の 5.06 g)、CoCl2.6H FeSO4.7H2O (50 mL の 4.99 g) (NH4) 6 ヶ月頃7O24.4H2O (50 ml 1.10 g)、CuSO4.5H2O (50 mL の 1.57 g)2O (50 mL の 1.61 g)。注: EDTA は、水を沸騰で解体されるべき、FeSO4は、酸化を避けるために最後用意する必要があります。 EDTA を除くすべてのソリューションを一緒に混合し、沸騰させます。EDTA を追加し、ソリューションが緑色に変わります。すべてを溶解後クール 70 ° C への解決策この温度でホット 20 %koh 溶液 (100 mL に 20 g) 85 mL を追加します。常温 (RT) 蒸留水 1 L にソリューションを調整します。 フラスコに綿のプラグを追加し、それを揺する 1 または 2 週間立つソリューション日 x 1。ソリューション必要があります最初は緑と紫、錆茶色の沈殿物; を残して電源を入れますソリューションがクリアされるまで、ろ紙を使用して沈殿物を削除します。試料を凍結し、-20 ° C で保存 次のコンポーネントを混合することによってc. クラミドモナス細胞を成長するタップ中 × 1 を準備: 溶液 (40 x) 25 mL、25 mL の溶液 B (40 倍) 1 mL Hutner の微量元素のバッファーの25、蒸留水 1 L に混合気を調整と。0.4 μ m フィルターを使用して混合物を滅菌します。 中心小体の浄化のためのメディアの準備 500 mL の蒸留水で調整の最終巻には 10 mM HEPES (pH 7) で 5% ショ糖を使用して deflagellation バッファーを準備します。 0.5 M 酢酸の 250 mL を準備します。 H2O パイプ粉体を溶解するための最初の追加の 50 mL の 1 M K パイプ ストック溶液 (pH 7.2) の 250 mL を準備し、解決するまで N KOH をクリアになる開始 10 を追加します。10 N 1 N 島と pH 7.2 に滴定し、H2O を 250 mL の最終巻にソリューションを調整 5 のショ糖液 (w/w) を次のとおり準備します。注: すべてのショ糖液 0.4 μ m フィルターを用いた可溶化は注射器に接続後、フィルターを適用する必要があります。60% と 70% ショ糖ソリューションが可溶化しにくいし、可溶化を容易にする 60 ° C に加温水槽に配置する必要がありますに注意してください。サッカロースは完全にまでは、10 分ごとをミックスします。 25% ショ糖を準備、ショ糖の 25 グラムの重量を量る、10 mM K パイプ (pH 7.2) を追加することにより 100 g 重量を調整します。 60% ショ糖を準備、ショ糖の 60 グラムの重量を量る 10 ミリメートル K パイプ (pH 7.2) 100 g に重量を調整します。 ショ糖密度勾配のショ糖液を準備します。ショ糖の 40 グラムの重量を量る 10 ミリメートル K パイプ (pH 7.2) 100 g ソリューションを調整することによって 40% ショ糖を準備します。同様に、50% (w/w) と 70% (w/w) ショ糖を準備します。 -20 ° C でソリューションを格納します。注意解凍後ショ糖ソリューションを正しく再懸濁します。 100 ml 混合 1 mm HEPES (pH 7) 換散バッファー、0.5 mM MgCl2、および 1 np-40、および維持の 4 ° C でそれ常に、実験の日にこのバッファーの新鮮なを準備します。中心小体分離日抗プロテアーゼ タブレットを追加します。 1 混合物のボリューム塩酸持参で KH2PO4蒸留 H2o. 調整 pH 7.4 に 800 mL の 0.24 g Na2HPO4、1.44 g、KCl の 2 g の塩化ナトリウム 8 g を混合することによってリン酸バッファー生理食塩水 (PBS) (pH 7.4) x 1 を準備します。蒸留 H2o ・ L 2. C. クラミドモナス由来の分離 注: は、図 1を参照してください。 文化とC. クラミドモナス細胞の拡大 1 日目の夕方、文化 1 10 ml 三角フラスコに固体板からcw15 -ひずみを接種するタップ x。23 ° C で 2-3 日間の白色蛍光灯 (60 Με/m2s) の下のセルを成長します。 3 日目、希釈文化 10 (100 mL) x 1 x をタップし、23 ° C で 2-3 日の光の下で細胞の成長 6 日に希釈文化 10 x 1 x でタップすると文化の 1 L を入手します。文化 〜 107セル/mL26 (日 9-10) x 1 のおおよその細胞密度を示す暗い緑の色に到達するまで 23 ° c の光の下で細胞を成長します。 C. クラミドモナス由来の精製 50 mL の円錐管で 10 分間 600 x gでcw15 -細胞を遠心します。ペレットを洗浄細胞の 50 mL の 1x PBS で 1 x と 100 mL のピペットで室温 deflagellation バッファーのペレット 600 x gで 10 分間再懸濁しますでそれをスピンします。 PH ショックで細胞をゆっくりと磁性攪拌器で 4.5-4.7 の最終的な pH に 0.5 M 酢酸の滴を追加することによって deflagellate し、2 分ゆっくりと pH を 7.0 に復元する 1 の N 島の滴の追加セルを孵化させなさい。 600 × g 10 分の戸建の鞭毛を削除するために細胞を遠心します。上澄みを除去し、氷の上にペレットを格納します。ペレット 2 x は 50 mL の 1x PBS 4 ° C で冷却のその後、4 ° C で 10 分間 600 x gでペレットをスピンします。 30 mL の 1x PBS でペレットを再懸濁し、(図 1B) を混合せずに 20 mL の 25% ショ糖クッションの上に懸濁液をゆっくりとロードします。 清; 残りの鞭毛を削除する 4 ° C で 15 分間 600 x gでスピンします。セルは 25% ショ糖 (図 1C) に広がっています。慎重に、吸引器を使用して上清を吸引によってのみ、一番 20 mL (赤矢印、図 1C) を保ちます。 20 mL の冷 1x PBS を追加することによって残りの 20 mL を洗浄します。4 ° C で 10 分間 600 x gでサンプルをスピンします。10 mL の (4 ° C) で冷 1x PBS でペレットを再懸濁します。次の換散は、一度にすべてのセルを当るように塊がないことを確認します。 新しい 250 ml にペレットを再懸濁を転送します。100 mL のセルに DNase の 5,000 単位を補完換散バッファーを追加します。セル、および他の方法で周りに換散バッファーを追加することが重要です。4 ° C で 1 h の混合物を孵化し、任意の気泡を形成することがなくボトル 15 分毎の反転によって慎重に混ぜます。 任意細胞の残骸を削除する 50 mL のコニカル チューブの 4 ° C で 10 分間の 600 x gで分離細胞を遠心します。細胞ペレットを白にする必要があります、溶解が正しく実行された場合 (図 1D)。ピペットで上澄みを収集し、氷上に置いた 60% ショ糖クッションを含む 30 mL 丸底チューブにそれをロードします。その後、4 ° C で 30 分間 10,000 x gでチューブをスピンします。注: いくつかの丸底チューブ (材料表) が必要で、培養上清の量に応じて。 ショ糖クッションの上 1 mL までの培養上清を吸引します。残りの上清 1 mL、2 mL ショ糖クッションの間黄色のインターフェイスに注意してください。優しく P1000 カットとショ糖および残りの上清をミックスします。この手順でボルテックスにかけないでください。それ以外の場合、procentrioles はこの段階で失われます。プールのすべてのショ糖クッション、氷の上に保管します。 薄肉 38.5 mL ポリプロピレン チューブに 40%-70% ショ糖密度勾配を準備するには、軽く 70% ショ糖 (4 ° C) で続いて 3 mL の 50% と 40% のショ糖の最後に、3 mL 3 mL を追加します。40%-70% ショ糖グラデーションにプールされたインターフェイスを読み込む冷たいショ糖は非常に粘性のため、ゆっくりとこれを行います。10 mM K パイプ バッファー (pH 7.2) と管のバランス、4 ° C で 1 時間 15 分の 68,320 x g (例えば、SW32Ti 回転体を持つ) でそれらを遠心力場 4 ° C で 12 x 500 μ L 分画を収集するには、異なるショ糖層を乱すことがなくチューブの底に 0.8 mm の針で穴を作るします。カット P200 ピペット チップで次の蛍光抗体法に使用される各画分から追加の 10 μ L の因数を準備します。液体窒素で分数をスナップ-凍結。注: 孤立した由来は、中心体の全体的な微細構造が保持されることを確保するための電子顕微鏡による分析できます。 3. Coverslips に分離由来の定量化: 遠心分離と蛍光抗体法 注: は、図 2を参照してください。 チューブと coverslips 準備 分数あたり 1 ガラス丸底チューブ (15 mL) を使用して、中心体画分 (合計 12 管) を分析します。 サポートのカスタム coverslip アダプター (アダプターを以下と呼ばれる) を丸底チューブに入れます。丸底チューブ滅菌 12 mm coverslip の場所。注意: 12 mm coverslips を使用してここで、18 mm coverslips 30 ml 丸底チューブを使用してのプロトコルを合わせることができます。 4 ° C で予冷 10 mm K パイプ (pH 7.2) 5 ml を追加します。Coverslip フローティングではないアダプターをご利用いただけますことを確認します。氷の上には、チューブを配置します。 中心体の遠心分離 コールド 10 mM K パイプ (pH 7.2) の 100 μ L で各 10 μ L 分画を希釈します。スクロース (図 2A) の完全な消失まで希釈を再懸濁します。丸底チューブにそれぞれの希釈割合をロードします。 4 ° C で 10,000 x gで 10 分間 (例えば、JS 13.1 スイング バケツ ローター) で管をスピンします。 アダプターのスロットの端にある穴に手作りフック デバイスを挿入して、coverslip を回復し、そっと持ち上げます。注: 手動でフックし、自家製棒 (図 2B 2D) に成形の注射針で自作フック装置が可能です。 丸底チューブの先頭に達すると、時に手袋をはめた指でアダプターの端をトラップし、ピンセットで、coverslip を削除します。Coverslip のどちら側に中心体が含まれていることに留意します。蛍光抗体法の coverslips の治療に進みます。 蛍光染色とイメージング分離C. クラミドモナス由来注: は、図 2を参照してください。 蛍光抗体法により次のように染色のための材料を準備します。 結晶ポリスチレン伝送ラボ ボックス (高さ 43 mm、幅 50 mm の長さは 60 mm) でカバー ガラス染色ラックを準備します。100% メタノールでそれを埋めるし、-20 ° C で保存 湿気の多い部屋を準備します。このため、水加湿の組織内部の横に配置することによって湿気のある商工会議所を組み立てるペトリ皿 (図 2E) の正方形のエッジ。シーリング ラップ研究室の一部を追加 (材料表参照) 蛍光抗体法の手順 (手順 3.3.2–3.3.3) の間に配置されます抗体ミックスをシャーレの中央に。ふたをし、光から保護するためにアルミ箔で湿気のある商工会議所をカバーしてください。 Immunostain として分離の由来に従います。 -20 ° C のメタノール (ステップ 3.3.1.1) にそれらをインキュベート ボックスで 5 分で遠心分離 (ステップ 3.2.4) 入力後中心体と直接、coverslips を修正します。 ピンセットと場所研究室の透明なボックスに 50 mL の 1x PBS でいっぱい (材料の表を参照してください)、室温で 5 分間洗って coverslips を削除します。 一次抗体のミックスの 60 μ L をピペット [0.05% と 1% ウシ血清アルブミン (BSA) で希釈した一次抗体 PBS でトゥイーン 20] 研究室の湿気のある部屋でラップをシールの部分に。ドロップに直接直面している中心体と抗体のミックスの上に coverslips をゆっくりと寝かせます。一次抗体と 45 分のため coverslips を孵化させなさい。注: 代表的な結果の生成に使用された一次抗体がウサギのポリクローナル Bld12 (1: 300) とマウス α-チューブリン (DM1A) (1: 300)。 Coverslips を削除し、1 × PBS で 5 分間洗って 3.3.2.2 の手順で説明するようします。1 %bsa および 0.05% を含む PBS で二次抗体と 45 分のため coverslips をインキュベート トゥイーン 20。注: 代表的な結果の生成に使用された二次抗体、アレクサ 488 (1:1, 000) と結合したヤギ抗マウスとヤギ抗うさぎ Alexa 568 (1:1, 000) に結合します。 Coverslips を削除し、1 × PBS で 5 分間洗って 3.3.2.2 の手順で説明するようします。 スライド ガラス上のスライドに媒体をマウントおよび上 (メディアをマウントに直面して由来)、coverslips を注意深く配置 3 μ L を追加することによって、coverslips をマウントします。マニキュアと coverslip エッジをシールします。 画像のデコンボリューション27を適用中 1.4 の n. a. と石油目的 X 63 共焦点顕微鏡の分離の由来 (材料の表を参照してください)。注: ここでは、次の設定が使用された: アレクサ 488 と Alexa 568 580-635 nm の 500-545 nm。 4、Coverslips の中央に由来の濃度 注: は、図 3を参照してください。 材料の準備 氷、(呼ばれるアダプター以下、.stl ファイル補足のファイル 1として提供) カスタム coverslip サポート アダプター、カスタム コンセントレーター (.stl ファイル補足のファイル 2として提供)、10 mM K パイプ (pH 15 mL ガラス丸底チューブを準備します。7.2) 4 ° C で ポリ-D-リジン (PDL) を準備-coverslips をコーティングします。10 x H2O を 1 mg/mL PDL の貯蔵液を希釈します。まず、70 %etoh、削除、エタノール、coverslips 乾燥させると coverslips を洗います。PDL を coverslips をコートし、室温で 30 分間インキュベートします。Coverslips 3 を洗って水で x と乾燥させます。注: は、分離の由来、coverslips に接続の数を増やすための PDL を coverslips をコートします。 遠心分離 凹に滅菌 12 mm coverslip の場所、PDL を維持、コンセントレーターの下端が下向きをコートします。上に直接アダプターを配置することによって、coverslip をキャップします。丸底チューブを反転し、コンセントレーター、coverslip、アダプターの上に置きます。 軽く丸底チューブの底部に達するまでピンセットでアンサンブルを押して、チューブを反転します。コンセントレーターの一番上に来るまで、丸底チューブ 10 mM K パイプ バッファー (pH 7.2) を追加します。コンセントレーターの中央のシリンダーで任意の気泡そこに残らないことを確認してください。 優しく豊かな中心小体分数を含む 1 つの因数に 10 ミリメートル K パイプ バッファー (pH 7.2) の 100 μ L を追加し、ボリュームを徹底的にミックスします。 コンセントレーターの中空部から 10 mM K パイプ バッファー (pH 7.2) の 100 μ L を削除し、内容が中空の中心に残ることを世話、コンセントレーターの中空部に 10 mM K パイプ バッファー (pH 7.2) の豊かな中心体分画の 100 μ L を追加します。 遠心 10,000 × gの 4 ° C で事前冷却遠心機 (例えば、JS 13.1 スイング バケツ ローター) 10 分 ピンセットで、コンセントレーターを削除します。 アダプターのスロットの端にある穴に手作りフック デバイスを挿入して、coverslip を回復し、そっと持ち上げます。丸底チューブの先頭に達すると、時に手袋をはめた指でアダプターの端をトラップし、ピンセットで、coverslip を削除します。Coverslip のどちら側に由来が含まれていることに留意します。蛍光抗体法の coverslips の治療に進みます。注: 手動でフックし、自家製棒 (図 2 b D) に成形の注射針で自作フック装置が可能です。 固定および濃縮由来の免疫蛍光染色手順 3.3.2–3.3.4 で実行します。 5. 単一粒子の平均 注: は、図 4を参照してください。 単一粒子の平均のためのイメージング 正規の耐フェード マウント媒体を使用してスライド上の coverslip をマウントします。CFI アポクロマート全反射の目的を使用して構造化照明顕微鏡 (2 D SIM) イメージングを実行 (100 X、NA 1.49 WD 0.12 mm) とバック点灯 EM CCD カメラ。注: 同期捕捉時間は 3 MHz から読み取るカメラで 100 ms に設定されました。2.5 X レンズが使用された SIM 用。注: ここに表示されているデータセットは、3-D SIM 顕微鏡に買収された (材料の表を参照してください)。 画像総中心小体を構成する画像の大規模なスタックを取得することによって中心体信号、中心小体信号の上下に上記の Z スタックの上部と下部の位置をそれぞれ設定。プロジェクトのスタックと 5.2 と 5.3 の手順に従って単一粒子の平均を実行に進みます。 スタックの投影 ImageJ で画像のスタックを開きます。をクリックして ‘→ スタックをイメージ → Z プロジェクト」。投影の種類を設定として最大強度’。 クリックして、イメージの反転 ‘編集 → 反転’。生成される投影を保存 (.tif 形式)。 Scipion 単一粒子整列 赤を押すと Scipion で新しいプロジェクトを作成」ページの上部に’のプロジェクトの作成] ボタン。左側のパネルでダブルクリック ‘輸入 → 輸入顕微鏡’。 入力、’ファイルのディレクトリ’と’パターン ‘フィールド データ ディレクトリおよび名前によると。既定のパラメーターを保持します。’実行’をクリックします。 ‘粒子 → ピッキング → xmipp3 – マニュアル (ステップ 1) を選ぶ’をダブルクリックします。’入力顕微鏡’フィールドの近くに虫眼鏡アイコンをクリックし、手順 5.3.1 から輸入された顕微鏡を選択します。’実行’をクリックします。 新しく開いたウィンドウでそれらをクリックして別の顕微鏡写真から粒子を選択します。すべての顕微鏡写真を完了したら、赤いボタン「+ 調整」をクリックしてします。 ‘粒子 → 抽出 → xmipp3 – 抽出粒子」をダブルクリックします。’入力座標’フィールドの近くに虫眼鏡アイコンをクリックし、手順 5.3.4 から選んだ座標を選択します。粒子寸法によると「粒子ボックス サイズ (px)」をご記入ください。「前処理」タブでダスト除去を設定: なし (それは成果物を生成することができます)。コントラストの反転: (黒い粒子、白背景)。位相反転: なし (CTF 補正にリンク);ノーマライズ: はい。 「実行」をクリックします。仕事が終わったらをクリックしジョブ (厚くなるボーダー) のボックスを選択して抽出された粒子をチェック ‘分析結果(メイン メニューの左下)。 ‘2 D → 整列 → xmipp3 – cl2d に合わせて’をダブルクリックします。’入力粒子’フィールドの近くに虫眼鏡アイコンをクリックし、手順 5.3.5 から抽出された粒子を選択します。参照イメージを使用しません。’実行’をクリックします。 ダブルクリックして、 ‘2 D → 整列 → もっと → xmipp3 – 配置を適用 2 d’。’入力粒子’フィールドの近くに虫眼鏡アイコンをクリックし、手順 5.3.7 から一直線に並べられた粒子を選択します。 5.3.6 の手順のように「実行」をクリックします。ジョブ ボックスの選択後「分析結果」をクリックしてして結果を確認できます。 されます ‘粒子 → マスク → xmipp3 – 2d のマスクを適用する」をダブルクリックします。 ‘入力粒子’フィールドの近くに虫眼鏡アイコンをクリックし、手順 5.3.9 から一直線に並べられた粒子を選択します。「マスク ソース」は、 「ジオメトリ」に設定されます。その後、マスク型としてマスクのパラメーターを設定: 円形;半径 (ピクセル): をクリックして、その周りに何もない 1 つの粒子 (中心小体) を探して、’魔法の杖 ‘ 、最適な値を見つけるためにウィンドウを開く左のアイコンシフト センター: なし (粒子は完全に中央に) 場合や (パーティクルが移動) する場合は Yes です。X 中心のオフセット: 粒子の位置によるとY センター オフセット: 粒子の位置によると。’実行’をクリックします。 「分析結果」ボタンを使用して、マスクが正しく適用されます。そうでない場合は、 ‘2 d をマスク [適用]ジョブを右クリックし、 ‘編集’を選択します。それもう一度「実行」ボタンを使用して (サイズおよび/またはシフト) マスクと実行パラメーターを変更します。 ‘2 D → 分類 → xmipp3 – cl2d’をダブルクリックします。 ‘入力粒子’フィールドの近くに虫眼鏡アイコンをクリックし、手順 5.3.11 から仮面の粒子を選択します。クラスの数は、1 クラス約 50 粒子を取得するはずです。’実行’をクリックします。 「分析結果」ボタンをクリックして、結果確認してください。開いたウィンドウで「何を」のすぐ隣に「目」アイコンをクリックします。 新しいウィンドウは、 ‘ブロック’メニューの’Classes2D’を選択することによって生成されたクラスの検査をできます。各クラスの内容をチェックするには、同じメニューの’Class00N_Particles’を選択します。唯一の悪い粒子が含まれているかを識別するために各クラスを検査します。’Classes2D’ビューに戻るし、それぞれをクリックして良い粒子を使用してクラスを選択します。選択時に押される「Ctrl」キーを保つことによっていくつかのクラスを選択することが可能です。 良い粒子のすべてのクラスが選択されている場合は、 ‘+ 粒子’これらの粒子にサブセットを作成するをクリックします。 同じウィンドウで粒子のさまざまな方向を表すクラスのいくつかのセットを選択します。新しいサブセットを作成するには、 ‘+ 平均’をクリックします。 各方向/平均の選択、次の手順に従います。 ‘2 D → 整列 → xmipp3 – cl2d に合わせて’をダブルクリックします。 ‘入力粒子’フィールドの近くに虫眼鏡アイコンをクリックし、手順 5.3.17 から良い粒子を選択します。’Yes’に’Use の参照イメージ’を設定します。’参照イメージ’フィールドの近くに虫眼鏡アイコンをクリックしてステップ 5.3.18 から’サブセットを作成ジョブに白い矢印左側クリックし、参照として使用するイメージを選択します。別のウィンドウで開き、どのオブジェクトをチェックするオブジェクトをダブルクリックします。’実行’をクリックします。 ダブルクリックして、 ‘2 D → 整列 → もっと → xmipp3 – 配置を適用 2 d’。’入力粒子’フィールドの近くに虫眼鏡アイコンをクリックし、5.3.19.2 のステップから一直線に並べられた粒子を選択します。 ‘実行’をクリックします。 アライメントの結果をチェック (‘分析結果);一直線に並べられた粒子は、これらの粒子の平均が表示されます。 平均は得意と粒子はすべて同じ方法で指向された場合をクリックして平均を保存’ 詳細 → ImageJ’と ImageJ で画像を保存します。 平均を改善することができます、よく指向のすべての画像を選択し、 ‘+ 粒子’ボタンで新しいサブセットを作成します。サブセットは (すべて悪い粒子を削除) きれいになるまでは、手順 5.3.19.1–5.3.19.4 を繰り返します。配置するたびに実行 (ステップ 5.3.19.2)、(平均品質向上のイテレーションにイテレーション) からは最後の生成のなかに参照が設定されます。