Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano
Summary
Este protocolo describe la ingeniería genética transitoria de células dentales extraídas del folículo dental humano. La estrategia de modificación no aplicada puede llegar a ser una base para la mejora de los productos terapéuticos de células madre.
Abstract
Hasta la fecha, varios tipos de células madre en diferentes etapas de desarrollo están en el foco para el tratamiento de enfermedades degenerativas. Sin embargo, ciertos aspectos, como la muerte celular masiva inicial y bajos efectos terapéuticos, problemas de su traducción clínica amplia. Ingeniería genética de células antes del trasplante surgió como un método prometedor para optimizar los efectos terapéuticos de células madre. Sin embargo, todavía carecen de sistemas de entrega de genes seguros y eficientes. Por lo tanto, el desarrollo de métodos adecuados puede proporcionar un enfoque para resolver los retos actuales en terapias basadas en células madre.
El presente Protocolo describe la extracción y caracterización de células madre de folículo dental humana (hDFSCs) así como su modificación genética no-virales. El folículo dental postnatal dio a conocer como una fuente prometedora y de fácil acceso para la recolección de las células madre adultas multipotentes que poseen potencial de proliferación alta. El procedimiento de aislamiento descrito presenta un método simple y confiable para cosechar hDFSCs de cordales. Este protocolo incluye también métodos para definir las características de células madre de células aisladas. Para la ingeniería genética de hDFSCs, una estrategia optimizada transfección catiónico base de lípidos se presenta introducción de microARN altamente eficiente que permite sin producir efectos citotóxicos. MicroRNAs son candidatos adecuados para la manipulación de celda transitoria, como estos pequeños reguladores traslacionales controlan el destino y el comportamiento de células madre sin el peligro de la integración del genoma estable. Así, este protocolo representa un procedimiento seguro y eficaz para la ingeniería de hDFSCs que puede llegar a ser importante para la optimización de su eficacia terapéutica.
Introduction
El folículo dental humano es un flojo Tejido fino conectivo de derivados de ectomesenchymally que rodea el diente en desarrollo1,2. Al lado de su función de coordinar la osteoclastogénesis y osteogénesis para el proceso de erupción del diente, este tejido presenta células madre y progenitoras especialmente para el desarrollo del periodonto3,4,5. Por lo tanto, el folículo dental se considera como una fuente alternativa para cosechar las células madre adultas humanas6,7.
Varios estudios demostraron que las células madre del folículo dental humana (hDFSCs) son capaces de diferenciarse en el linaje periodontal incluyendo osteoblastos, fibroblastos del ligamento y cementoblastos8,9,10 . Además, estas células fueron demostradas para que coincida con todas las características de las células estromales mesenquimales (MSCs) incluyendo la capacidad de auto renovación, adhesión plástica, expresión de marcadores de superficie específicos (por ejemplo,, CD73, CD90, CD105) así como osteogénico, adipogenic y condrogénica diferenciación potencial11,12,13. Otros estudios también revelaron un potencial de diferenciación de los nervios de hDFSCs2,14,15,16,17,18.
Debido a sus prometedoras propiedades y fácil acceso, hDFSCs se convirtió recientemente relevantes para tejido ingeniería19,20,21. Los primeros estudios se concentraron en el potencial de DFSCs para regenerar hueso periodontal y dientes raíces19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Desde el conocimiento de la capacidad neurogénica de hDFSCs, su aplicación como tratamiento potencial para las enfermedades neurodegenerativas ha sido investigado31,32,33. HDFSCs también han cobrado importancia con respecto a la regeneración de otros tejidos (p. ej., epitelio corneal)34,35. El potencial terapéutico de hDFSC no se basa sólo en su potencial de diferenciación directa sino también en su actividad paracrina. Recientemente, hDFSCs se han demostrado para secretar una gran cantidad de factores bioactivos, como las metaloproteinasas de matriz (MMPs), factor de crecimiento insulínico (IGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento básico del fibroblasto (bFGF) y el crecimiento de hepatocito factor (HGF), que desempeñan un papel crucial de la angiogénesis, inmunomodulación, remodelación de la matriz extra celular y procesos reparativos36.
Sin embargo, amplia traducción clínica de la terapia de células madre se deteriora aún por varios desafíos, como la muerte masiva de células iniciales y células beneficioso bajo efectos37,38. Ingeniería genética proporciona una estrategia prometedora para abordar estos desafíos y por lo tanto, puede realzar grandemente la eficacia terapéutica de células madre38,39,40. Para la manipulación de celda transitoria, microRNAs (miRs) son los candidatos idóneos, como estos pequeños reguladores traslacionales controlan el destino y el comportamiento de las células madre sin el peligro de genoma estable integración41,42, 43. hasta la fecha, se han identificado varios miRs beneficiosos promover la proliferación de la célula de vástago, supervivencia, homing, actividad paracrina, así como su diferenciación en varios linajes44. Por ejemplo, miR-133a ingeniería MSCs mostraron un aumento de la supervivencia y el engraftment en corazones de rata infartado, dando por resultado una función cardíaca mejorada en comparación con MSCs45. Además, miR-146a MSCs expresando mostraron secretan mayores cantidades de VEGF, que a su vez condujo a una mayor eficacia terapéutica en el tejido isquémico46.
Este manuscrito presenta un protocolo detallado para la extracción selectiva y la ingeniería genética de hDFSCs. Para ello, describimos la digestión enzimática y cosecha de los folículos dentales humanas, así como el aislamiento posterior de hDFSCs. Para caracterizar las células aisladas, instrucciones importantes para la verificación de propiedades MSC se han incluido siguiendo las directrices de la sociedad internacional de terapia celular13. Además, ofrecemos una descripción detallada para la generación de hDFSCs miR-modificado por aplicación de una estrategia de transfección basada en lípidos catiónicos y la evaluación de la eficiencia de transfección y citotoxicidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las células madre adultas están en foco para el tratamiento de varias enfermedades degenerativas. En particular, ósea la médula (BM)-derivado de las células madre, incluyendo las células madre hematopoyéticas (HSCs) y MSCs, están bajo intensa investigación clínica47. Sin embargo, BM la cosecha es un procedimiento invasivo que causa dolor en el sitio de la donación y puede conducir a eventos adversos48. Recientemente, el tejido dental postnatal ha emergido como un…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el programa de Cajamarca del centro médico de la Universidad de Rostock (889018) y la Fundación húmeda (2016-11). Además, P.M. y R.D. son apoyados por el BMBF (VIP + 00240).
Materials
| Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA1557A488 | Clone SN6, monoclonal |
| Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA928A488 | monoclonal |
| APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody | BD Biosciences | 559883 | Clone MAR4, monoclonal |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555751 | Clone MOPC-21, monoclonal |
| PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody | BD Biosciences | 550257 | Clone AD2, monoclonal |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555749 | Clone MOPC-21, monoclonal |
| PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody | BD Biosciences | 339217 | Clone 104D2, monoclonal |
| PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 557872 | Clone MOPC-21, monoclonal |
| PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody | BD Biosciences | 560531 | Clone G44-26, monoclonal |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 558304 | Clone 27-35, monoclonal |
| PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody | BD Biosciences | 561557 | Clone 5E10, monoclonal |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 55095 | Clone MOPC-21, monoclonal |
| V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody | BD Biosciences | 560777 | Clone HI30, monoclonal |
| V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 560787 | Clone X40, monoclonal |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | 0.5M, pH 8.0 |
| Steritop | Merck Millipore | SCGPT05RE | 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PFA | Merck Millipore | 1040051000 | |
| Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit | R&D Systems | SC006 | |
| RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17120 | 5 nmol |
| Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17110 | 5nmol |
| Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | polyclonal |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | polyclonal |
| Mounting medium; Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | histology mounting medium |
| ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Zeiss | ||
| BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
| ZEN2011 software | Zeiss | ||
| Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) | Biochrom | L2143 | in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+ |
| Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| PBS (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH: 7.4; w/o: Ca and Mg |
| P-S-G (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11039021 | |
| Antibiotic, ZellShield | Biochrom | W 13-0050 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| Collagenase type I | Thermo Fisher Scientific | 17100017 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm | Braun | 4099206 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,547,254 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Sarstedt | 833,910,002 | |
| Cell culture flask, 25 cm2 | Sarstedt | 833,911,002 | |
| Freezing medium, Biofreeze | Biochrom | F 2270 | |
| Cryotubes | Thermo Fisher Scientific | 377267 | 1.8 mL |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4 % |
| Counting chamber | Paul Marienfeld | ||
| Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% | Mibe | ||
| NaCl solution | Braun | 0.9 % | |
| Vicryl satures, Vicryl rapide | Ethicon | 3 – 0 |
Referenzen
- Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
- Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
- Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
- Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
- Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D’Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
- Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
- Park, B. -. W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
- Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
- Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
- Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
- Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096 (2016).
- Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015 (2017).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
- Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
- Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
- Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin – promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, 167-175 (2009).
- Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
- Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
- Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), 627-638 (2015).
- Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
- Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
- Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
- Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
- Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
- Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
- Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix – based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
- Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig’s epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
- Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
- Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114 (2015).
- Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183 (2015).
- Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005 (2017).
- Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326 (2017).
- Sung, I. -. Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
- Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
- Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300 (2017).
- Lee, S., Choi, E., Cha, M. -. J., Hwang, K. -. C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902 (2015).
- Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
- Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
- Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063 (2016).
- Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F., #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. , (2016).
- Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
- Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
- Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
- Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
- Seo, H. -. H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
- Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406 (2009).
- Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Andrades, J. A. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. , (2013).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
- Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
- Seo, B. -. M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
- Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
- Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
- Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
- Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
- Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154 (2014).
- Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
- Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), 295-312 (2014).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
- Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
- Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879 (2016).
- Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113 (2017).
- Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
- Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
- Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , (2010).
- Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).
