Isolement, caractérisation et axée sur les micro-ARN de la Modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire
Summary
Ce protocole décrit le génie génétique transitoire dentaire des cellules souches extraites du follicule dentaire humaine. La stratégie appliquée modification non viraux peut-être devenir une base pour l’amélioration des produits thérapeutiques des cellules souches.
Abstract
A ce jour, plusieurs types de cellules souches à différents stades de développement sont dans la mise au point pour le traitement des maladies dégénératives. Pourtant, certains aspects, tels que la mort cellulaire massive initiale et faible d’effets thérapeutique, avec facultés affaiblies à leur traduction clinique large. Génie génétique des cellules souches avant la greffe a émergé comme une méthode prometteuse pour optimiser les effets thérapeutiques des cellules souches. Cependant, les systèmes de prestation sûre et efficace de gène manquent encore. Par conséquent, le développement de méthodes appropriées peut fournir une approche pour résoudre les défis actuels dans les thérapies à base de cellules souches.
Le présent protocole décrit l’extraction et la caractérisation des cellules souches de follicule dentaire humaine (hDFSCs) ainsi que leur modification génétique non viraux. Le follicule dentaire postnatal dévoilé comme une source prometteuse et facilement accessible pour la récolte des cellules souches multipotentes adultes possédant le potentiel élevé de prolifération. La technique d’isolation décrit présente une méthode simple et fiable pour récolter des hDFSCs de dents de sagesse. Ce protocole comprend également des méthodes pour définir les caractéristiques des cellules souches de cellules isolées. Génie biomoléculaire de hDFSCs, une stratégie optimisée transfection de base de lipides cationiques est présentée habilitante introduction microARN hautement efficace sans causer d’effets cytotoxiques. MicroARN sont des candidats appropriés pour la manipulation de cellules transitoires, comme ces petits régulateurs translationnelles contrôlent le devenir et le comportement des cellules souches sans danger d’intégration génome stable. Par conséquent, ce protocole représente une procédure sûre et efficace pour l’ingénierie des hDFSCs qui peut devenir important pour optimiser leur efficacité thérapeutique.
Introduction
Le follicule dentaire humain est un tissu conjonctif lâche dérivé ectomesenchymally entourant la dent en développement1,2. À côté de sa fonction de coordonner osteoclastogenesis et ostéogenèse pour le processus d’éruption de dent, ce tissu contenant des cellules souches et progénitrices en particulier pour le développement du parodonte3,4,5. Par conséquent, le follicule dentaire est considéré comme une source alternative de récolter les cellules souches humaines adultes6,7.
Plusieurs études ont démontré que les cellules souches humaines follicule dentaire (hDFSCs) sont capables de différencier dans la lignée parodontale incluant des ostéoblastes, les fibroblastes du ligament et les cémentoblastes8,9,10 . En outre, ces cellules ont été montrés pour correspondre à toutes les caractéristiques des cellules stromales mésenchymateuses (CSM), y compris capacité autorenouvellement, adhérence plastique, expression des marqueurs de surface spécifiques (par exemple, CD73, CD90, CD105) aussi bien qu’ostéogénique, adipocytaire et chondrogéniques différenciation potentiels11,12,13. D’autres études ont également révèlent un potentiel de différenciation neurale de hDFSCs2,14,15,16,17,18.
En raison de leurs propriétés prometteuses et un accès facile, hDFSCs est devenu récemment pertinentes pour tissus techniques19,20,21. Les premières études se concentrent sur le potentiel de DFSCs de régénération osseuse, parodontale et dent racines19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. La connaissance de la capacité neurogène de hDFSCs, leur application comme traitement potentiel pour les maladies neurodégénératives depuis enquête31,32,,33. HDFSCs ont également gagné en importance à la régénération des autres tissus (p. ex., l’épithélium cornéen)34,35. Le potentiel thérapeutique des hDFSC ne repose pas seulement sur leur potentiel de différenciation direct mais aussi sur leur activité paracrine. Récemment, il a été démontrés que hDFSCs sécrètent une multitude de facteurs bioactifs tels que les métalloprotéinases matricielles (MMP), facteur de croissance analogue à l’insuline (IGF), facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) et croissance hépatocyte facteur (HGF), qui jouent un rôle crucial dans l’angiogenèse, immunomodulation, remodelage de la matrice extra-cellulaire et processus réparateur36.
Cependant, large traduction clinique de thérapie de cellules souches est encore affaiblie par plusieurs défis, comme la mort massive de cellules initiales et bas les cellules souches bénéfiques effets37,38. Le génie génétique prévoit une stratégie prometteuse pour relever ces défis et donc peut améliorer grandement l’efficacité thérapeutique de cellules souches38,39,40. Pour la manipulation de cellules transitoires, microARN (miRs) sont des candidats, comme ces petits régulateurs translationnelles contrôlent le devenir et le comportement des cellules souches sans le danger du génome stable intégration41,,42, 43. a ce jour, plusieurs miRs bénéfiques ont été identifiés en favorisant la prolifération des cellules souches, survie, homing, activité paracrine ainsi que leur différenciation en plusieurs lignées44. Par exemple, miR-133 a machiné MSCs ont montré une augmentation de la survie et la prise de greffe dans les coeurs de rats infarci résultant en une amélioration de la fonction cardiaque par rapport aux non modifiées MSCs45. De même, miR-146 a MSCs sur-exprimant apparaissaient à sécréter des quantités plus élevées de VEGF qui a conduit à un renforcement de l’efficacité thérapeutique dans les tissus ischémiques46.
Ce manuscrit présente un protocole détaillé pour l’extraction sélective et l’ingénierie génétique des hDFSCs. À cette fin, nous avons décrit la digestion enzymatique et récolte des follicules dentaires humains, ainsi que l’isolation ultérieure de hDFSCs. Afin de caractériser les cellules isolées, des instructions importantes pour la vérification des propriétés MSC ont été incluses conformément aux directives de la société internationale de thérapie cellulaire13. En outre, nous fournissons une description détaillée pour la génération de hDFSCs miR-modifiée en appliquant une stratégie axée sur les lipides cationiques de la transfection et l’évaluation de l’efficacité de transfection et cytotoxicité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules souches adultes sont actuellement en discussion pour le traitement de plusieurs maladies dégénératives. En particulier, OS a moelle (BM)-dérivées de cellules souches, y compris les cellules souches hématopoïétiques (CSH) et MSCs, sont sous investigation clinique intensive47. Cependant, récolte de BM est une procédure invasive provoquant une douleur sur le site de don et peut conduire à des effets indésirables,48. Récemment, le tissu dentaire postna…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le programme FORUN de l’Université de Rostock Medical Centre (889018) et la Fondation humide (2016-11). En outre, h. et R.D. sont pris en charge par le BMBF (VIP + 00240).
Materials
| Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA1557A488 | Clone SN6, monoclonal |
| Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA928A488 | monoclonal |
| APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody | BD Biosciences | 559883 | Clone MAR4, monoclonal |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555751 | Clone MOPC-21, monoclonal |
| PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody | BD Biosciences | 550257 | Clone AD2, monoclonal |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555749 | Clone MOPC-21, monoclonal |
| PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody | BD Biosciences | 339217 | Clone 104D2, monoclonal |
| PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 557872 | Clone MOPC-21, monoclonal |
| PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody | BD Biosciences | 560531 | Clone G44-26, monoclonal |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 558304 | Clone 27-35, monoclonal |
| PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody | BD Biosciences | 561557 | Clone 5E10, monoclonal |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 55095 | Clone MOPC-21, monoclonal |
| V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody | BD Biosciences | 560777 | Clone HI30, monoclonal |
| V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 560787 | Clone X40, monoclonal |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | 0.5M, pH 8.0 |
| Steritop | Merck Millipore | SCGPT05RE | 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PFA | Merck Millipore | 1040051000 | |
| Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit | R&D Systems | SC006 | |
| RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17120 | 5 nmol |
| Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17110 | 5nmol |
| Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | polyclonal |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | polyclonal |
| Mounting medium; Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | histology mounting medium |
| ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Zeiss | ||
| BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
| ZEN2011 software | Zeiss | ||
| Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) | Biochrom | L2143 | in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+ |
| Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| PBS (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH: 7.4; w/o: Ca and Mg |
| P-S-G (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11039021 | |
| Antibiotic, ZellShield | Biochrom | W 13-0050 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| Collagenase type I | Thermo Fisher Scientific | 17100017 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm | Braun | 4099206 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,547,254 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Sarstedt | 833,910,002 | |
| Cell culture flask, 25 cm2 | Sarstedt | 833,911,002 | |
| Freezing medium, Biofreeze | Biochrom | F 2270 | |
| Cryotubes | Thermo Fisher Scientific | 377267 | 1.8 mL |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4 % |
| Counting chamber | Paul Marienfeld | ||
| Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% | Mibe | ||
| NaCl solution | Braun | 0.9 % | |
| Vicryl satures, Vicryl rapide | Ethicon | 3 – 0 |
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