In Vitro Formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: Análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia
Summary
Se describen métodos para aislar caninas neutrófilos de la sangre entera y visualizar la formación neta en vivo neutrófilos mediante microscopía de fluorescencia. También se describe son protocolos para cuantificar la formación neta y citrulinado histona H3 (citH3) expresión usando microscopia de la inmunofluorescencia.
Abstract
En respuesta a la invasión de patógenos, neutrófilos liberan trampas extracelulares neutrófilos (redes), que son redes extracelulares de ADN con las histonas y proteínas antimicrobianas. Formación de red excesiva (NETosis) citH3 liberación durante la sepsis se asocia con múltiples disfunción del órgano y la mortalidad en ratones y seres humanos y sus implicaciones en los perros son desconocidos. Aquí, describimos una técnica para aislar caninas neutrófilos de la sangre entera para la observación y cuantificación de NETosis. Plasma rico en leucocitos, generado por sedimentación de dextrano, se separa por medios de separación gradiente de densidad disponible comercialmente y granulocitos recolectaron para la cuenta y las pruebas de viabilidad de la célula. Para observar en tiempo real NETosis en vivo neutrófilos, florescente de la célula y la célula impermeant ácido nucleico fluorescente manchas se agregan a neutrófilos activados por lipopolisacárido (LPS) o forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). Con el tiempo se observan cambios en la morfología nuclear y formación de red por microscopía de fluorescencia. In vitro NETosis se caracteriza por co-colocalization sin células ADN de (cfDNA), mieloperoxidasa (MPO) y citrulinado histona H3 (citH3) utilizando un protocolo modificado de immunolabelling doble. Cuantificar objetivamente la neta formación y expresión de citH3 utilizando microscopía de fluorescencia, redes y células citH3-positivas se cuantifican de manera cegada utilizando software disponible. Esta técnica es un análisis específico para evaluar la capacidad en vitro de los neutrófilos caninos a NETosis.
Introduction
Neutrófilos son de breve duración granulocitos responsables de la defensa inicial contra los patógenos invasores. Neutrófilos, reclutados en el sitio de la infección, eliminan microorganismos por fagocitosis, degranulación y generación de oxígeno reactivo (ROS) las especies1. En presencia de bacterias y endotoxinas, neutrófilos liberación neutrófilo extracelular trampas (redes), compuestas de cromatina extracelular decoración con las histonas y las proteínas granulares como elastasa y mieloperoxidasa (MPO)2. Aunque redes tienen propiedades antimicrobianas indispensables, cada vez mayor evidencia experimental y clínica sugiere que entusiasta formación neta durante la sepsis puede llevar a múltiples órgano disfunción y muerte3,4, 5 , 6.
Porque las redes pueden desempeñar un papel patofisiológico similar en perros, las intervenciones terapéuticas que prevengan o disminuyen la formación de la red pueden servir como estrategias de tratamiento novedosas en animales sépticos. Por esta razón, hay una necesidad de una técnica confiable evaluar y cuantificar NETosis y componentes netos en perros. Componentes netos como nucleosomas ADN libre de células (cfDNA) han sido evaluados previamente en neutrófilos caninos y plasma de perros clínica7,8,9. Usando análisis de fluorescencia, Goggs y Letendre encontraron que perros sépticos tienen niveles más altos de cfDNA de perros sanos8. Aunque estas técnicas son altamente objetiva y cuantitativa, medición de la cfDNA y nucleosomas como marcadores de la NETosis no es específica ya que pueden derivar de células necróticas que no sean de NETosing neutrófilos. Aquí describimos una técnica que utiliza la microscopía de fluorescencia para examinar los comportamientos de los neutrófilos NETosing vivo. También detallamos un protocolo modificado usando doble inmunomarcación para cuantificar subjetivamente las redes y sus componentes como la MPO y citH3 en neutrófilos caninos10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentamos aquí un protocolo para observar los cambios en núcleos conformación y cfDNA comunicado en vida canina neutrófilos utilizando un colorante florescente de la célula y un tinte impermeant del celular. La principal ventaja de este ensayo es que permite para la detección en tiempo real de formación red por microscopía de alta resolución en vivo neutrófilos sin fijación de la célula, por lo tanto, proporciona una herramienta sencilla y valiosa para la observación en vitro de neta formación. P…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor fue financiado por la Morris Animal Foundation (D15CA-907). El estudio fue apoyado por fondos de la Universidad de California, Davis, centro de salud equina y centro de salud de animales de compañía (2016-24-F). Los autores desean reconocer Geena Ng su asistencia con las figuras y Nghi Nguyen para su ayuda con el video.
Materials
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
Referenzen
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
- Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
- Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
- Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
- Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemie. 45 (39), 11727-11736 (2006).
