تحديد وعزل أوليجوبوتينت والنسب التي ارتكبت النقوي موروث من نخاع العظام الماوس

وحيدات، العَدلات، والخلايا الجذعية (DCs) هي النقوي الخلايا التي تنشأ من فروعه المكونة للدم في نخاع العظام، أساسا بعملية تسمى ميلوبويسيس. موروث النقوي المشتركة (CMPs) لديها القدرة على إنتاج خلايا النقوي، فضلا عن ميجاكاريوسيتيس والكريات الحمراء، ولكن الخلايا اللمفاوية لا. موروث المحببات الوحيدات (غمبس)، التي هي مستمدة من CMPs، تنتج المحببة ووحيدات، ولكن قد فقدت ميجاكاريوسيتي وكرات الدم الحمراء المحتملة. وحيدات والكلاسيكية وأيضا بلاسماسيتويد DCs (المؤلفان/pDCs) ويعتقد أن تنشأ من فروعه المشتركة المعروفة باسم المتكفل الوحيدات-DC (مدبس)، التي يتم إنتاجها بواسطة CMPs. تدريجيا في نهاية المطاف يؤدي تقييد إمكانات النسب النسب التي ارتكبت فروعه: المتكفل المحببات والوحيدات المتكفل والخلايا الجذعية موروث (الشكل 1).

ويسمان والزملاء أفادت أن CMPs موجودة في لين^– ج-كيت⁺ هيئة الأوراق المالية-1^– CD34 (LKS^–)⁺ FcγR^لو جزء بسيط من الماوس نخاع العظام، بينما ترد غمبس في CD34 LKS^{– +} FcγR ^مرحبا جزء¹. ومع ذلك، هذه الكسور “كيوتو” و “جي أم بي” متباينة للغاية. على سبيل المثال، كسر “GMP” يحتوي أيضا على موروث النسب التي ارتكبت المحببات والوحيدات موروث^1،2. مدبس أفيد كل على حدة بأن CX3CR1⁺ Flt3⁺ CD115⁺ فروعه أيضا تعبر عن CD34 و FcγR^3،4. مدبس تثير cDC/الحزب الديمقراطي المسيحي-إنتاج مشترك DC موروث (توضع)، التي أبلغت للتعبير عن مستويات أدنى من ج-كيت (CD117) ولم يتم تضمينها في جزء LKS^{– 5}.

وكان يفترض مسبقاً أن وحيدات تنشأ عن طريق مسار واحد (CMP-GMP-الديمقراطي-الوحيدات). يتفق مع هذا موروث النموذج، وارتكبت الوحيدات التي تنتجها غمبس (المسمى المتكفل الوحيدات، أعضاء البرلمان)² ومدبس (المسمى شيوعاً الوحيدات موروث، كموبس)⁶ يبدو أن نفس الخلايا على أساس التعبير علامة السطحية المشتركة . ومع ذلك، نحن مؤخرا أظهرت أن وحيدات تصدر بشكل مستقل عن غمبس ومدبس، وكانت قادرة على التمييز بين أعضاء البرلمان، وكموبس ب تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة⁷.

مؤخرا قمنا بتعديل استراتيجية “GMP” النابضة ويسمان “كيوتو” لتحديد اﻷفخاذ 6 C57BL/6J الماوس نخاع العظام التي تحتوي على أوليجوبوتينت مختلفة ومجموعات فرعية السلف النقوي النسب التي ارتكبت. نحن ذكرت أولاً أن تلطيخ ل Ly6C و CD115 يسمح بعزل غمبس أوليجوبوتينت، فضلا عن فروعه المحببات (GPs) وفروعه الوحيدات (MPs وكموبس، ونحن حاليا غير قادر على فصل) من “جي أم بي” جزء² (LKS ^– CD34⁺ FcγR^مرحبا البوابة؛ الشكل 1). أظهرنا في وقت لاحق أن مدبس هي في الأغلب في جزء “كيوتو” (CD34 LKS^{– +} FcγR^لو البوابة)، الذي يحتوي أيضا على Flt3⁺ CD115^لو و Flt3^– المجموعات الفرعية⁷ (الرقم 1 ). ⁺ CD115^لو كسر CMP-Flt3 غلة غمبس ومدبس عند نقل التبني. مجموعة فرعية CMP-Flt3^– يحتوي على فروعه التي تظهر أن تكون وسيطة بين غمبس و^لو خلايا CMP-Flt3⁺ CD115. على عكس مدبس، تمتلك CMP-Flt3⁺ CD115^لو والكسور CMP-Flt3^– أيضا ميجاكاريوسيتي وكرات الدم الحمراء المحتملة.

من المهم أن نلاحظ، مع ذلك، أنه من غير الواضح حاليا ما إذا كان يتضمن كسور “كيوتو” فروعه التي هي حقاً أوليجوبوتينت (مثل الخلايا الفردية داخل CMP-Flt3⁺ CD115^لو كسر التي تمتلك العَدلات، الوحيدات، العاصمة، ميجاكاريوسيتي، وكرات الدم الحمراء المحتملة)، أو بدلاً من ذلك، تضم خليطا فروعه مع إمكانات النسب أكثر تقييداً. وكشفت مستعمرة تشكيل فحوصات (الثقافات methylcellulose) الخلايا مع المحببات (العَدلات) وكرات الدم الحمراء والوحيدات و megakaryocyte المحتملة (جيم الخلايا) في “كيوتو”، CMP-Flt3⁺ CD115^لو والكسور CMP-Flt3^{– 1 ،7}، ولكن لا تسمح بتقييم إمكانات DC. وفي المقابل، مستعمرة تشكيل فحوصات أثبتت وجود أوليجوبوتينت غمبس (فروعه مع العَدلات والوحيدات المحتملة) في جزء “GMP”^1،2، وهذا معتمد من قبل الأخيرة وحيدة الخلية تحليل ترانسكريبتوميك⁸. لا حاليا المعروف، ومع ذلك، ما إذا كانت هذه غمبس أوليجوبوتينت أيضا إنتاج المحببة الأخرى (الحمضات، الاسسه، وخلايا mast).

استناداً إلى هذه الدراسات، تبين لنا الآن كيف السطح 7 علامات (ج-كيت، هيئة الأوراق المالية-1، CD34، FcγR، Flt3، Ly6C و CD115) يمكن استخدامها لتحديد وعزل هذه المجموعات الفرعية 6 أوليجوبوتينت وفروعه النقوي النسب التي ارتكبت. يمكن تطبيق البروتوكول الموصوفة هنا في المختبر فحوصات الثقافة (الثقافات methylcellulose أو السائل)، في فيفو تجارب نقل التبني في الفئران، والتحليل الجزيئي (تسلسل الحمض النووي الريبي السائبة وخلية واحدة، النشاف الغربية، إلخ).

البروتوكول ويتكون من 3 مراحل: 1) إعداد تعليق خلية مفردة لنخاع العظم خلايا، 2) إثراء ل 3) تحديد، فروعه المكونة للدم (الفرز المغناطيسي تنشيط الخلية)، وعزله إذا رغبت، من مجموعات فرعية السلف بالتدفق الخلوي (باستخدام محلل أو من أرز، حسب الاقتضاء). الخطوة الأولى هو عزل خلايا نخاع العظام من قصبة وتيبياس من الفئران euthanized ومشابه للأخرى بروتوكولات تم وصفه مسبقاً⁹. بعد ذلك، أثري العينة للخلايا الجذعية والسلف باستخدام خليط من الأجسام المضادة ضد علامات خلية سطح الكريات الحمراء، العَدلات، وحيدات، الخلايا الليمفاوية، إلخ، إلى استنزاف الخلايا المتمايزة. وهذا ليس إلزامياً، ولكن الموصى به بشدة لتحسين الكشف عن المجموعات السلف، وتقليل كمية الأجسام المضادة اللازمة لتحديد السلف والوقت المطلوب للتدفق الخلوي. بروتوكول نضوب النسب أدناه توضح استخدام الماوس النسب خلية استنفاد عدة فرز الخلايا ماجنيتيكاكتيفاتيد (ماك) (الذي يحتوي على أضداد بيوتينيلاتيد CD5، CD45R (B220)، CD11b وغرام-1 (Ly6G/C)، 7-4، ومكررا ثانيا-119، بالإضافة إلى مكافحة البيوتين ميكروبيدس) وفاصل مغناطيسي الآلي. والخطوة الأخيرة هي تحديد (والفرز، وإذا رغبت في ذلك) من المجموعات السلف بالتدفق الخلوي. الفريق الضد المبينة أدناه (انظر أيضا الجدول 1) قد صممت لاستخدامها في تدفق سيتوميتير (محلل أو أرز) مع الليزر 4 (405 نانومتر، 488 نانومتر، 561 نانومتر، 640 nm).

رقم 1: المتكفل العَدلات والوحيدات والعاصمة ومسارات التمايز. ويوضح النموذج المنقح مؤخرا من ميلوبويسيس⁷ ، مع بوابات وايزمن عن “CMPs” (أزرق) و “غمبس” (أخضر)¹ مضافين. لقد تم تعديل هذا الرقم من يانيز et al. عام 2017⁷. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-