Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

Miles de mutaciones somáticas relacionadas con el desarrollo de cáncer han sido reportados¹. Entre éstos, algunos son marcadores predictivos de la eficacia de la terapia dirigida ^2,3 y detección de estas mutaciones genética es la práctica clínica habitual ahora. Tecnología PCR (ddPCR) digital de la gotita puede utilizarse para monitorizar la presencia o la ausencia de mutaciones con precisión de detección alta y es altamente compatible con biopsias líquido no invasivos^4,5. Sin embargo, ensayos de ddPCR actual están diseñados principalmente para detectar las mutaciones conocidas a priori. Esto limita severamente el uso de ddPCR como una herramienta de descubrimiento cuando la mutación es desconocida. De hecho, en el diseño convencional de ddPCR, una sonda de hidrólisis reconociendo el alelo de tipo salvaje (WT sonda) compite con una sonda específica reconociendo el alelo mutante (MUT Probe) (figura 1A). La sonda con mayor afinidad cruza por hibridación a la plantilla y libera su fluoróforo, indicando la naturaleza del alelo correspondiente. Los datos de fluorescencia obtenidos para cada gotita se pueden visualizar en un diagrama de dispersión que representa la fluorescencia emitida por las sondas WT y MUT en diferentes dimensiones. Una representación esquemática de un resultado típico de un ensayo de ddPCR convencional se presenta en la figura 1A. En este ejemplo, la nube azul corresponde a las gotitas que contienen alelos WT identificados por la punta de prueba de peso, mientras que la nube roja corresponde a gotitas en el que el alelo MUT ha sido amplificado e identificado por la sonda MUT. Dependiendo de la cantidad de DNA en la reacción, doble positivo gotitas que contienen peso y MUT amplicones pueden aparecer (nube verde). La nube gris clara corresponde a gotas de vacías.

Puesto que la mayoría de las plataformas permite la detección de un número limitado de fluoróforos (generalmente 2, pero hasta 5), rendimiento de ddPCR convencional es limitado. Por lo tanto, dirigida a las regiones con múltiples mutaciones adyacentes requiere diseño de técnicamente difícil ensayos multiplex ddPCR o el uso de múltiples reacciones dirigidas a cada mutación en paralelo. La estrategia de ddPCR de entrega, supera esta limitación como es potencialmente capaz de detectar cualquier alteración genética dentro de una región de destino utilizando un único par de sondas de hidrólisis WT. La primera cubre sonda (sonda 1) es complementaria a la secuencia de la WT de la región de destino donde las mutaciones son una secuencia no variable, adyacente a la región de destino y la segunda sonda (sonda 2) espera (figura 1B). Mientras que la primera punta de prueba cuantifica la cantidad total de amplificable moléculas en la reacción, la segunda sonda discrimina alelos WT y MUT óptimo hibridación a las secuencias mutantes. Punta de prueba 2 puede identificar varios tipos de mutaciones en la región (substituciones del nucleótido único o múltiples, eliminación, etc.) de destino⁶. Como en ddPCR convencional, la nube gris clara corresponde a las gotas que contienen no las moléculas de ADN. Es importante recordar que en este tipo de análisis, separación óptima de WT y MUT nubes depende de la cantidad de ADN cargado en la reacción, ya que no se pueden distinguir las gotitas que contienen alelos objetivo WT y MUT de gotitas que contienen sólo el peso forma. Por lo tanto, este análisis requiere que la mayoría de las gotas contienen no más de una copia del gen objetivo.