ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

何千もの癌の開発に関連する体細胞突然変異は報告された¹をされています。これらのうち、いくつかの標的療法^2,3の有効性予測マーカー、遺伝のこれらの突然変異のスクリーニングは今日常診療。液滴デジタル PCR (ddPCR) の技術は高い検出精度と突然変異の有無を監視するため、非侵襲的な液体生検^4、5と高い互換性。ただし、試金 ddPCR 現在主に先天的な知られている突然変異を検出する設計されています。突然変異が知られている場合、これは深刻な検出ツールとして ddPCR の使用が制限されます。確かに、従来の ddPCR デザインの野生型対立遺伝子 (WT プローブ) を認識し加水分解プローブは突然変異体の対立遺伝子 (MUT プローブ) (図 1 a) を認識し、特定のプローブと競合します。高い親和性プローブは、テンプレートに交配し、対応する遺伝子の性質を示す、その蛍光を解放します。各液滴の得られた蛍光データは、別の次元で WT とムトのプローブによって放出される蛍光を表す散布で視覚化できます。従来の ddPCR の試金のための典型的な結果の概略は、図 1 aに提示されます。この例では、青、雲は水滴、MUT の対立遺伝子が増幅され MUT プローブによって識別されるに対応する赤い雲に対し WT プローブによって識別される WT 対立遺伝子を含んでいる小滴に対応します。反応に読み込まれている DNA の量、に応じて WT とムトの産物を含む二重肯定的な液滴は (緑雲) を表示できます。光の灰色の雲は、空の液滴に対応します。

以来、ほとんどのプラットフォームは、フルオロ (通常 2、5 までが) の限られた数の検出を実現、従来の ddPCR のスループットが制限されています。したがって、複数の隣接する遺伝子変異を有する地域をターゲット技術的に困難な多重 ddPCR 試金または並行各突然変異を対象とする複数の反応の使用の設計が必要です。WT 加水分解プローブの一意のペアを使用してターゲット領域内の遺伝的改変を検出できる可能性があるので、ドロップオフ ddPCR 戦略はこの制限を克服します。ターゲット地域と 2 番目のプローブ (プローブ 2) に隣接する非可変シーケンスは突然変異が、対象地域の WT シーケンスに補足最初のプローブ (プローブ 1) のカバーには、(図 1 b) が期待されています。最初のプローブは、反応における無衝突分子の合計量を定量化中、2 番目のプローブは突然変異体シーケンスにサブ最適な交配によって WT とムトの対立遺伝子を識別します。プローブ 2 は、複数のターゲット地域 (単一または複数のヌクレオチドの置換、削除、等)⁶の突然変異の種類を識別できます。従来の ddPCR のように光の灰色の雲は、DNA 分子を含まない水滴に対応します。それはこのタイプの試金、WT とムトの雲の最適な分離は WT だけを含んでいる小滴から WT とムトのターゲット遺伝子を含んでいる小滴を区別できないので、反応に読み込まれている DNA の量に依存していることを思い出すことが重要フォーム。したがって、この試金はほとんど水滴が目標とされた遺伝子の 1 つ以上のコピーを含める必要があります。