Seule goutte numérique PCR pour la détection complète et simultanée des Mutations dans les régions de Hotspot

Des milliers de mutations somatiques liées au développement du cancer ont été signalés¹. Parmi ceux-ci, quelques-uns sont des marqueurs prédictifs de l’efficacité de la thérapie ciblée ^2,3 et dépistage de ces mutations génétique est pratique clinique de routine maintenant. Gouttelette numérique technologie PCR (ddPCR) peut être utilisée pour surveiller la présence ou l’absence de mutations avec une précision de détection élevé et est hautement compatible avec biopsies liquide non invasif^4,5. Cependant, les tests de ddPCR actuellement sont principalement conçus pour détecter les mutations connues a priori. Ceci limite fortement l’utilisation de ddPCR comme un outil de découverte lorsque la mutation est inconnue. En effet, lors de la conception conventionnelle de ddPCR, une sonde d’hydrolyse reconnaissant l’allèle sauvage (WT sonde) est en concurrence avec une sonde spécifique reconnaissant l’allèle mutant (MUT sonde) (Figure 1 a). La sonde avec une affinité plus élevée s’hybride au modèle et libère ses fluorophore, indiquant la nature de l’allèle correspondant. Les données de fluorescence obtenues pour chaque gouttelette peuvent être visualisées dans un nuage de points représentant la fluorescence émise par les sondes em et MUT de différentes dimensions. Une représentation schématique d’un résultat typique pour un dosage ddPCR conventionnelle est présentée dans la Figure 1 a. Dans cet exemple, la nuée bleue correspond à des gouttelettes contenant des allèles WT identifiées par la sonde WT, alors que le nuage rouge correspond à gouttelettes où l’allèle MUT a été amplifié et identifiée par la sonde MUT. Selon la quantité d’ADN chargé dans la réaction, des gouttelettes positives doubles contenant des amplicons fois WT et MUT peuvent apparaître (Nuage vert). Le nuage gris clair correspond à gouttelettes vides.

Étant donné que la plupart des plates-formes permettant la détection d’un nombre limité de fluorophores (généralement 2, mais jusqu’à 5), un débit de ddPCR conventionnelle est limité. Cibler des régions présentant des mutations adjacentes multiples exige donc, design de techniquement difficiles ddPCR multiplex essais ou l’utilisation de multiples réactions ciblant chaque mutation en parallèle. La stratégie de ddPCR Drop-off, permet de surmonter cette limitation car il peut éventuellement détecter toute modification génétique dans une région cible à l’aide d’une paire de sondes d’hydrolyse WT. Le premier sonde (Probe 1) couvrant qu’une séquence non variable, adjacente à la région cible et la deuxième sonde (sonde 2) est complémentaire de la séquence WT de la région cible où les mutations sont attendus (Figure 1 b). Alors que la première sonde quantifie le montant total des molécules amplifiables dans la réaction, la deuxième sonde discriminatoire WT et MUT allèles par hybridation sous-optimal de séquences de mutants. Sonde 2 peut identifier plusieurs types de mutations dans la région (substitutions nucléotidiques simples ou multiples, suppression, etc.) la cible⁶. Comme dans les ddPCR classique, le nuage gris clair correspond à gouttelettes ne contenant aucune des molécules d’ADN. Il est important de rappeler que dans ce type de test, une séparation optimale des nuages WT et MUT est tributaire de la quantité d’ADN chargé dans la réaction, puisque les gouttelettes contenant les WT et MUT allèles cible ne peut pas être distinguées de gouttelettes contenant uniquement le WT formulaire. Par conséquent, ce test nécessite que la plupart des gouttelettes contiennent pas plus d’une copie du gène ciblé.