Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ
Summary
Wir haben einen einfachen und anpassungsfähigen Workflow zur Fluoreszenz-Imaging-basierte zellbiologischen Studien Proteinaggregation und selbstverdauende Fluss in das zentrale Nervensystem der Drosophila -Modelle von quantitativen Daten entlocken entwickelt. Neurodegeneration.
Abstract
Mit der steigenden Verbreitung von neurodegenerativen Erkrankungen ist es zunehmend wichtig, die zugrunde liegende Pathophysiologie zu verstehen, die zu neuronalen Dysfunktion und Verlust führt. Fluoreszenz-imaging-Tools und Technologien ermöglichen beispiellose Analyse der subzellulären neurobiologischen Prozesse, doch gibt es noch eine Notwendigkeit für Objektive, reproduzierbare und zugänglich Ansätze zur Extraktion von quantifizierbaren Daten aus bildgebenden Verfahren . Wir haben einen einfachen und flexiblen Workflow um quantitative Daten von Fluoreszenz basierende bildgebenden Studien mit Drosophila Modelle der Neurodegeneration zu extrahieren entwickelt. Im einzelnen beschreiben wir einen easy-to-Follow, halbautomatischen Ansatz mit Fidschi/ImageJ um zwei zelluläre Prozesse zu analysieren: Erstens quantifizieren wir aggregierte Proteingehalt und Profil in der Drosophila -Optik-Lappen mit Leuchtstoff-Tags Mutant Huntingtin-Proteine; und zweitens bewerten wir Autophagie-Lysosomen Flussmittel in Drosophila visuellen Systems mit ratiometrischen basierende Quantifizierung der fluoreszierenden Tandem Reporter der Autophagie. Wichtig ist, enthält das Protokoll hier skizzierten einen semi-automatischen Segmentierung Schritt um sicherzustellen, dass alle fluoreszierende Strukturen analysiert werden, um Selektionsbias zu minimieren und Auflösung der subtilen Vergleiche zu erhöhen. Dieser Ansatz für die Analyse von anderen biologischen Zellstrukturen erweitert werden kann und Prozesse verwickelt in Neurodegeneration, wie proteinhaltige Puncta (Stress-Granulat und synaptischen komplexe), sowie Membrane-springen Fächer (Mitochondrien und Menschenhandel membranvesikel). Diese Methode bietet eine standardisierte, noch anpassbar Referenz für Bildanalyse und Quantifizierung, und könnte Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit über das Feld erleichtern, und letztlich mechanistisches Verständnis der Neurodegeneration verbessern.
Introduction
Neurodegenerative Erkrankungen betreffen Millionen von Menschen jedes Jahr und die Häufigkeit nimmt mit einer alternden Bevölkerung1. Während jeder Neurodegenerative Erkrankung hat eine einzigartige Ätiologie, zeichnen Aggregation fehlgefaltete Proteine und Aufschlüsselung des proteostase Netzwerks gemeinsame pathologische viele dieser Krankheiten. Erläuterung, wie die Störung dieser grundlegenden und zusammenhängende Prozesse schief geht ist als Beitrag zu neuronalen Dysfunktion und Zelle Tod entscheidend für Verständnis neurodegenerativen Erkrankungen sowie therapeutische Interventionen führen. Fluoreszenz-basierte Bildgebung ermöglicht eine Untersuchung dieser komplexen und dynamischen Prozesse in Neuronen und trug wesentlich zum Verständnis der neuronalen Zelle Biologie. Analyse von eindringmittel tagged Proteinen ist anspruchsvoll, vor allem, wenn Experimente in Vivo, aufgrund der äußerst kompakten Gewebe, verschiedene Zelltypen und morphologischen Heterogenität durchgeführt werden. Manuell assistierte Quantifizierung ist erschwinglich und einfach, aber ist oft zeitaufwändig und unter menschlichen Vorspannung. Daher gibt es eine Notwendigkeit für Objektive, reproduzierbare und zugänglich Ansätze zur Extraktion von quantifizierbaren Daten aus bildgebenden Verfahren.
Wir haben einen einfachen und anpassungsfähigen Workflow mit Fidschi/ImageJ, eine leistungsfähige und frei zugänglichen Bildverarbeitungs-Software2,3, um quantitative Daten aus Fluoreszenz bildgebenden Studien in experimentellen Modellen der skizziert. Neurodegeneration mit Drosophila. Anhand dieses Protokolls Proteinaggregation und selbstverdauende Flussmittel Quantifizierung – zwei Handy-biologischen Funktionen, die für Neurodegenerative Krankheit-Pathologie von großer Bedeutung sind — wir bewiesen die Sensitivität und Reproduzierbarkeit dieses Ansatzes. Analyse der Gewebekulturen tagged mutierte Huntingtin (Htt) Proteine in der Drosophila -Optik-Lappen ergab die Anzahl, Größe und Intensität von proteinaggregaten. Wir visualisieren einen Tandem fluoreszierende Reporter des selbstverdauende Flusses in Drosophila visuellen Systems, die verschiedenen Emission Signale je nach wohnzimmertaugliche Umwelt4anzeigt. Ratiometrischen basierende Analyse des Tandem Reporter für eine quantitative und umfassende Ansicht der Autophagie-Lysosomen Flux von Autophagosome Bildung, Reifung und Transport zu einer Verschlechterung in den Lysosomen zulässig, und zusätzlich hervorgehoben anfällig Fächer in neurodegenerativen Erkrankungen gestört. Wichtig ist, finden Sie in beiden Analysen halbautomatische Schwellwerte und Segmentierung Schritte in unser Protokoll zu minimieren unbewusste Vorurteile, Probenahme-Leistung zu erhöhen, und bieten einen Standard, um Vergleiche zwischen ähnlichen Studien zu erleichtern. Die einfache Workflow soll mächtige Fidschi/ImageJ Plugins (entwickelt von Informatikern, basierend auf mathematischen Algorithmen) zugänglicher Neurobiologen und die Life-Sciences-Gemeinschaft insgesamt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Protokoll lässt sich vehement und reproduzierbar quantitate Zelle biologische Prozesse visualisiert durch Fluoreszenz-basierte Bildgebung. Zusammenhang mit biologischen und technischen Einschränkungen müssen sorgfältig geprüft werden, um das experimentelle Design führen. Fluoreszierenden Marker der subzellulären Strukturen von Interesse, ob immunhistochemische, farbstoffbasierte oder genetisch ausgedrückt, müssen über Hintergrund von Morphologie und Intensität unterscheiden. FH/GAL4</…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird unterstützt durch die Sheila und David Fuente neuropathischen Schmerzen Forschung Programm Graduate Fellowship (zu J.M.B.), Lois Pope LIFE Fellows Programm (, C.L., Y.Z und J.M.B.), die Snyder-Robinson Foundation Predoctoral Fellowship (zu cl), Dr. John T . Macdonald Foundation (CL), Verträge, Bewilligungen von der National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 und R56NS095893 (zu R.G.Z.), und von Taishan Gelehrter Project (Provinz Shandong, Volksrepublik China) (R.G.Z.).
Materials
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
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