哺乳动物系统 CRISPR 指南 RNA 克隆

注: 下面的协议概述了如何使用在线工具执行 gRNA 设计 (步骤 1.1-1.4), 这是 gRNA 质粒结构的所有方法的共同之处, 详述了本手稿。一旦确定了所需的 gRNAs, 就会描述订购必要寡核苷酸的步骤, 以及几种不同的方法, 将寡核苷酸引入表达载体 (如pSB700)。提出了2种方法克隆单导表达载体的基础上, 要么结扎成一个简化的表达载体 (步骤 2-7.3) 或金门克隆 (步骤 8-8.4)。进一步概述了克隆成对导表达载体的战略, 使用聚合酶链反应 (PCR) 后, 金门克隆 (步骤 11-16)。最后, 还概述了执行大肠杆菌化学转化的常用方法 (步骤 9-9.6) 和表达式向量序列验证 (步骤10到 10.2.3)。 设计 gRNA 寡核苷酸使用在线工具如下。 设计 gRNAs 使用在线工具, 如 sgRNA 记分2.0 在线工具 (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13或替代品, 如广泛的 sgRNA 设计工具 (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-设计)14和另外几个15。 使用基因名称、符号或原始 DNA 目标序列生成潜在的 gRNA 序列。注意: 创建一个电子表格 (. csv/. xls) 文件, 其所有潜在 gRNAs 针对该基因或提供的序列。如果使用的是 sgRNA 记分员2.0 在线工具, 或者如果采用了广泛的 sgRNA 设计工具, 则潜在 gRNAs 的质量将被报告为分数。这两种措施都是根据目标切割活动而得出的。 在分级 gRNAs 时, 请考虑 gRNA 选择中的非目标活动。注: 最佳导则是那些具有最大的目标效率和最小非目标活动。为了激活 (CRISPRa), gRNAs 的目的是针对该地区从 1-200 bp 上游的转录起始点 (TSS)4,15。对于抑制 (CRISPRi), gRNAs 的设计目标是从 50 bp 上游的 tss, 直到 300 bp 下游的 tss5。为了禁用一个基因使用 Cas9 切割, gRNAs 设计目标的第一个 10-50% 的编码序列下游的起始密码子 (因为 gRNAs 目标的 3 ‘ 末端的基因已被证明是不太有效的)13。 如果将寡核苷酸用于金门克隆, 确保不存在内部 BsmBI 站点, 因为这将导致退火的寡核苷酸被消化13。 选择基因组目标序列, 并删除单 gRNA 寡核苷酸序列修改 (例如, 起始序列: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG) 的 3 ‘ NGG PAM (只留下 protospacer 序列)。注意: 如果使用电子表格, 下面的公式将删除 3 ‘ NGG: = 左 (A2, LEN (A2)-3), 其中 A2 是包含目标序列和 PAM 的单元格。 将CACCG追加到寡聚 5 ‘ 末端。注: 结扎后的 pSB700 骨干, 这一序列将包括 3 ‘ 结束的 U6 启动者驱动转录的 gRNA。”CACC” 序列确保寡核苷酸与 BsmBI 消化 pSB700 载体的悬垂性相容。”G” 是聚合酶 III. 促进剂的要求, 并确保有效地启动 gRNA 的转录。在电子表格中使用以下公式执行此任务: = 串联 (“CACCG” (B2)), 其中 B2 是包含 protospacer 序列的单元格 [例如, 将 5 ‘ CACCG 序列添加到 protospacer: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (此是所订购的最后向前寡聚)]。 创建 protospacer 序列的反向补全 (rc)。注: 例如, 上述 protospacer 的反向补充是 TGGATGAGGGAGAGCACGCG。 将 AAAC 追加到 rc protospacer 的 5 ‘ 端。附加一个额外的 C 到 3 ‘ 端的 rc protospacer (反向寡核苷酸)。注意: “AAAC” 序列确保寡核苷酸与克隆成 BsmBI 消化 pSB700 载体相容。额外的 “C” 在 3 ‘ 末端是需要的退火序列到开始的 “G” 添加到前寡核苷酸。使用电子表格中的以下公式执行此任务= 串联 (“AAAC”、(C2)、”C”), 其中 C2 是包含反向补序列的单元格 [例如, AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (这是最终的反向寡聚订购)]]。 点寡核苷酸, 不加修饰寡核苷酸。 要求最低数量的寡核苷酸, 因为只有非常小的数量是需要的克隆反应。 稀释冻干底漆到最终浓度为100微米的 1x TE 缓冲器 (10 毫米三氯, pH 7.5 与1毫米 EDTA)。 整除1:1 向前和反向寡核苷酸 (例如, 10 ul 每一个) 成 PCR 带帽管。注意: 这将允许快速克隆许多 gRNAs 在一次使用多通道吸管。 漩涡和自旋向下的寡聚混合物 (100 x g 十五年代)。在设置结扎前, 在室温下孵育5分钟的反应。注意: 没有必要加热, 然后冷却的寡糖混合物, 以促进其退火。值得注意的是, 3-4 对 gRNA 寡核苷酸可能被汇集和退火在一个单一的反应 (例如, 混合 3 ul 前和 3 ul 的反向寡核苷酸一起从多达 4 gRNA 寡聚对, 给出了总容量 24 ul)。用于退火的寡核苷酸的体积可以调整以适应用户的需要。注: 步骤 6-7.3 描述 pSB700 的简化。有关另一种方法, 请参见步骤 8, 其中描述了单步 BsmBI 限制结扎。 文摘 1-5 微克的选择 pSB700 指南表达载体与 BsmBI (0.5 ul 每1微克) 为 1 h 在55°c15。进行 pSB700 gRNA 表达载体的消化, 总容积为 40 ul (表 1)。 在 1.5% (重量/卷) 低熔点琼脂糖凝胶上运行消化产物。 切出的消化矢量骨干带, 这相当于一个片段的 9 kb 的大小, 并把凝胶切片在1.5 毫升离心管 (图 1)。 根据制造商的说明, 使用商业凝胶纯化试剂盒从琼脂糖凝胶中提取 DNA。 将 DNA 洗脱 10-15 ul 的 TE 缓冲器 (10 毫米三, ph 7.5; 10 毫米三, ph 8.0) 获得浓缩洗脱液。 在 20 ul 反应 (表 2) 中, 结扎从步骤4到 BsmBI 消化 pSB700 引导表达载体的退火 gRNA 寡核苷酸, 将 gRNA 寡核苷酸克隆到预消化的 pSB700 表达载体中。 首先, 添加水, 缓冲, 和 DNA, 然后涡的混合物和添加酶, 漩涡1最后的时间后加入酶和旋转的解决方案 (100 x g 为十五年代)。夜间在室温下孵化反应。 包括无插入阴性对照反应, 仅有 BsmBI 消化载体, 没有退火 gRNA 寡糖插入。1 ul 的水可以用来代替 1 ul 的 gRNA 寡核苷酸为无插入阴性控制。 继续进行转换 (步骤 9)。注意: 步骤8是对 pSB700 的简化的一种替代方法, 如步 6-7.3 所述。 引入 gRNA 寡核苷酸 (在步骤 1-5.1 中概述) 进入 pSB700 载体, 通过使用金门克隆为单步 BsmBI 限制结扎。 装配主混合 (1 x)-如果正在克隆多个 gRNAs, 则在不添加加核苷酸的情况下准备主混合 (表 3)。整除将主组合成 PCR 管, 使用多通道吸管从步骤4.2 中添加 gRNA 寡核苷酸。包括使用 1 ul 水的无插入控制。 通过将 BsmBI 酶和 T4 DNA 连接酶在同一反应中, 实现同时进行限制消化和结扎 (即金门克隆)。使用以下简单的门协议来消化向量和结扎在1反应: 保持反应在37°c 为 2 h, 在50°c 为10分钟, 在65°c 为15分钟, 在80°c 为15分钟, 并且最后, 保持在摄氏4摄氏度。 注意, 在使用此方法之前, 请验证寡核苷酸不包含 BsmBI 站点。如果正在克隆的 gRNAs 包含 BsmBI 限制站点, 则在添加 BsmBI 时将对它们进行消化。这将阻止用户获取任何转化。 在最初简单的门反应以后, 增加另外 0.5 ul BsmBI 酵素到每个反应并且安置他们回到在55°c 为 1 h。消化后, 保持反应在4摄氏度或冻结它, 直到准备转变。这第二轮的限制酶孵化去除任何未消化或 religated 野生型 pSB700 向量主干从反应混合物, 以便只有接受了寡核苷酸插入的载体保持完好, 并将产生转化。 继续进行转换 (步骤 9)。 将反应混合物的 0.5 ul 转换成 8 ul 的合格大肠杆菌[例如, 纳布 DH5a (1-3 x 109 cfu/µg pUC19 DNA) 或纳布稳定 1-3 x 109 cfu/µg 的 pUC19 DNA)。对于慢病毒载体质粒, 纳布稳定细胞将提供更一致的粒产量。 将大肠杆菌从贮藏处取出-80 摄氏度, 在冰上解冻 5-10 分钟。 添加 0.5 ul 的反应混合到 8 ul 的合格大肠杆菌, 并保持在冰上的混合物30分钟。 热冲击混合物在42°c 四十五年代。 在冰上休息2分钟。 恢复在 250 ul 的 SOC 介质旋转振动筛上的文化为1小时的 DH5a 和30°c 的纳布马厩。 板材 80 ul 文化在适当的抗生素抵抗溶源性肉汤 (磅) 板材和孵化它隔夜在37°c 为纳布 DH5a 并且在30°c 为纳布马厩 [例如, pSB700 被镀在磅与氨苄西林 (100 微克/毫升) 板材] (图 3)。 验证 gRNA 表达质粒的序列: 用 5 ‘-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3 ‘ 在 gRNA 寡聚物上游 U6 启动子上的素数来验证每个菌落的序列。 选择 2-3 殖民地每反应为排序 (表 4)。注意: 一些测序提供商现在提供的服务可以直接从细菌菌落进行, 这大大降低了时间和成本, 消除了在测序前净化质粒的需要。或者, 质粒分离试剂盒可用于从单个细菌克隆中回收质粒 DNA。然后, 可以提交纯化质粒进行测序。如果进行了联合结扎反应, 请使用表 4作为对应选择和提交用于排序的殖民地数目的指南。 在序列确认之后, 分离出 gRNA 表达质粒。 使用无菌吸管尖端接种所需的蚁群成5毫升培养基, 含有100微克/毫升氨苄西林的 pSB700 表达载体。 在 100 rpm 37 摄氏度的旋转孵化器中生长细胞 (如果使用纳布马厩, 30 摄氏度)。 按照制造商的协议, 用质粒准备试剂盒将质粒 DNA 从培养基中分离出来。注意: 虽然上述方法使用户能够创建单一的 gRNA 矢量, 但此协议将允许用户创建包含 2 gRNAs 的向量, 每个矢量由它们自己的 RNA 聚合酶 III 启动子驱动。 对于配对的 gRNA 设计, 请使用上面概述的 sgRNA 设计工具 (步骤 1.1-1.4) 中的输出文件, 然后选择2个感兴趣的参考线。 对于激活或压制, 请选择至少 30 nt 的参考线对。 对于用于切割的 gRNAs, 选择在该基因中针对2不同外显子的参考线。 在下面的说明中, 指定数组 gRNA 中的第一个 gRNA 和数组 gRNA B 中的第二个 gRNA, 以创建配对的 gRNA 寡核苷酸序列修改。注: 用于创建 gRNA 的寡核苷酸将被称为 fA, 而用于引入 gRNA 的反向寡聚将被称为 rB。下面的克隆方法在每个 gRNAs 的 5 ‘ 端自动追加一个起始 G。 按如下所示创建适当的 fA 寡核苷酸。注:20 核苷酸组成的 gRNA 目标序列 gRNA-A 将构成初始 fA 序列后, 将建立以下步骤 (例如, protospacer-aggggctacaccactcattg)。 将 TTTTCGTCTCTCACCG 追加到 fA 的 5 ‘ 末尾 (例如序列 TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg)。 将GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA追加到 fA 的 3 ‘ 末尾 (例如, 序列 TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA)。这是最终版本的 fA 寡核苷酸将被订购。 创建必要的 rB 寡聚, 如下所示。注: 由 gRNA B 组成的 gRNA 目标序列的20核苷酸将构成初始 rB 序列, 以下步骤将生成 (例如, 起始序列 gtcccctccaccccacagtg)。 采取 rb = (revcom) rb (如cactgtggggtggaggggac) 的反向补充。 将 TTTTCGTCTCTAAAC 追加到 (revcom) rB (TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac) 的 5″末尾”。 将CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG追加到 3 “(revcom) rB (如TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG) 的末尾。这是将被订购的 rB 寡核苷酸的最终版本。注: 以下公式可用于通用电子表格软件自动编辑寡聚序列: = 串联 (“TTTTCGTCTCTCACCG”, (A2), “GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA”), 其中 A2 是包含 fA 序列的单元格, 而=串联 (“TTTTCGTCTCTAAAC”, (B2), “CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG”), 其中 B2 是包含 (revcom) rB 序列的单元格。 从选择的综合供应商处订购寡核苷酸。不需要进行其他修改。 利用制备的质粒 DNA 对 fA 和 rB 引物进行 PCR。这将附上向前和反向 gRNAs 从这个质粒产生的 PCR 片段, 并将允许每一个从它自己的启动子 (U6 和7SK 促进者-不同的发起人在这个设计中使用, 以防止病毒重组)。 使用 Phusion GC 特殊 PCR 协议创建所需的片段: 保持混合物在98°c 为1分钟 (1 周期), 在98°c 为十五年代, 在53°c 十五年代, 在65°c 为2分钟, 并且在72°c 为4分钟 (30 个周期), 然后按住它在4°c (表 5)。 在1% 琼脂糖凝胶上运行 PCR 产品, 并验证1波段是否见过 490 bp (图 2)。 使用凝胶萃取试剂盒切割和提取此 PCR 产品。将 DNA 洗脱为 15 ul 的 TE 缓冲器 (10 毫米三, ph 7.5; 10 毫米三, ph 8.0) 或蒸馏水。 用分光光度计测定提取产物与 pSB700 载体的浓度, 用于 DNA 浓度计算。将 PCR 产物和载体正常化为 40 femtomoles/ul 的浓度。注: 有几个网站可帮助根据 dna 的长度和溶液浓度 (如完成公司有关: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html？calc=ugpmols) 来计算给定 dna 溶液的浓度。计算器使用公式:在这里, N 是核苷酸序列的长度。 使用步骤 8-8.4 中概述的协议建立同时限制消化和结扎反应, 将 PCR 片段克隆成 pSB700 向量。 而不是添加 1 ul 的底漆溶液的反应, 添加 1 ul 的 40 fmole/ul 的 PCR 产品。此外, 使用 1 ul 的 pSB700 向量集中 40 fmole/ul。注: 等摩尔比率导致一致的结果, 虽然即使在不使用确切比率的情况下, 也可以获得菌落。 在完成金门反应过程 (步骤 8-8.4), 进行转换和序列验证 (步骤 9-10.2.3)。