أجبر اللعاب كأسلوب لتحليل اختصاص البعوض ناقل
Summary
لكفاءة السيطرة على البعوض يوضع انتقال الفيروس، المعرفة بإمكانيات مكافحة ناقلات البعوض الحامل لكل منها أهمية خاصة. يصف لنا اللعاب القسري كوسيلة لتحليل المتجهات اختصاص Aedes albopictus وثلاثة من الأصناف Culex مختلفة لانتقال الفيروس Zika.
Abstract
ويعرف اختصاص ناقلات إمكانات الأنواع البعوض أحيل فيروسات المنقولة بالبعوض (موبوفيروس) إلى مضيف فقاريات. وتحال جزيئات الفيروس قابلة للتطبيق خلال وجبة الدم عن طريق اللعاب من بعوضة مصابة. فحوصات اللعاب القسري السماح بتحديد الإمكانات ناقلات الأمراض على أساس واحد البعوض، تجنب استخدام التجارب على الحيوانات. الأسلوب مناسبة لتحليل عدد كبير من البعوض في تجربة واحدة ضمن فترة قصيرة من الوقت. واستخدمت فحوصات اللعاب القسري لتحليل البعوض الفردية 856 محاصرين في ألمانيا، بما في ذلك اثنان مختلفة المتعايشة Culex pipiens pipiens ، Culex تورينتيوم ، فضلا عن Aedes albopictus، التي كانت مصابة تجريبيا فيروس زكى (زيكف) والمحتضنة في 18 درجة مئوية أو 27 درجة مئوية لاثنين وثلاثة أسابيع. وبينت النتائج عدم وجود اختصاص متجه للأصناف Culex مختلفة زيكف. وفي المقابل، Aedes albopictus كان عرضه زيكف، ولكن فقط في 27 درجة مئوية، مع معدلات انتقال مماثلة إلى مستعمرة مختبر بعوض الزاعجة المصرية اختبارها في نفس الوقت.
Introduction
في عام 2015، Zika الفيروسات (زيكف)، ترتبط فيروسات المنقولة بالبعوض (موبوفيروس) لعائلة فيروسات مصفرة، ظهرت في كولومبيا، والبرازيل، وانتشر بسرعة عبر الأمريكتين ومنطقة البحر الكاريبي، مما تسبب في حدوث وباء مع عدد ملحوظ الحالات السريرية لصغر الرأس و متلازمة غيان – باريه1. تعتبر البعوض هذه الأنواع بعوض الزاعجة المصرية Aedes albopictus ناقلات الابتدائية والثانوية من زيكف2، ولكن الأنواع الأخرى من جنس بعوض ثبت أيضا أن يكون ناقل التجريبية اختصاص3 . على عكس الأنواع بعوضة ، ومعظم الأنواع Culex اختبارها حتى الآن ليست قادرة على نقل الفيروس4. مجرد، قدمت بيانات Culex quinquefasciatus 3من النتائج غير حاسمة. وفي الوقت الحاضر، هناك نقص في المعلومات اختصاص البعوض ناقل زيكف تحت ظروف الحرارة المعتدلة (< 20 درجة مئوية). ومع ذلك، هذه المعلومات جوهرية لتقييمات المخاطر الحيزات الممكنة إلى المناطق ذات المناخ المعتدل مثل أوروبا الوسطى.
ناقل مختصة زيكف غير قادرة على الحصول على والحفاظ على، وتضخيم وأخيراً نقل الفيروس. ولذلك، اختبار هيئات البعوض أو أجزاء من الجثث، بما في ذلك الساقين، أو الأمامي أو الرأس أو الغدد اللعابية، زيكف لا يكفي لتحديد اختصاص متجه. وملزمة لاختبار لجزيئات الفيروسات المعدية داخل اللعاب المفرج عنهم. لتقييم كفاءة ناقل، معدل الإصابة (الأشعة تحت الحمراء، وعدد من الهيئات البعوض زيكف الإيجابية الواحدة عدد من البعوض محتقن) ومعدل انتقال (TR، عدد من البعوض مع اللعاب زيكف الإيجابية الواحدة وعدد من الهيئات البعوض زيكف الإيجابية)، يجب أن تكون العزم. يمكن تحليل IRs للبعوض بسهولة عن طريق البعوض ببساطة المتجانس متبوعاً عكس المنتسخة في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-qPCR) استهداف زيكف. وعلاوة على ذلك، يمكن وصف العدوى كذلك بتحديد أرقام نسخ الفيروسية كل البعوض. وفي المقابل، تحليل معدلات انتقال يعتمد على الكشف عن جزيئات الفيروس قابلة للتطبيق في لعاب البعوض الفردية. يمكن تحقيق هذا عن طريق تغذية البعوض المصابة في الحيوانات المضيفة عرضه، يليها تحليل فريميا في المضيف5. ومع ذلك، هذا الأسلوب يعتمد على الكائنات نموذج مناسب، ومكلف ومقيد باللوائح الرفق بالحيوان. لتجنب استخدام الحيوانات المختبرية لتحليل معدلات انتقال العدوى وتخفيض التكاليف، مصطنعة إعادة تغذية نظم استخدام الدم قطرات قد وصف6. ومع ذلك، اختبار مقياس الفردية جنبا إلى جنب مع عدد كبير من الأفراد صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. وصف أولاً فحص اللعاب على مقياس فردية ونشر في عام 19667 وخلال السنوات الأخيرة، أصبحت تجارب اللعاب القسري الأسلوب المفضل تقييم كفاءة ناقل من البعوض3،8 .
بناء على دراستنا اختصاص متجهة من “أوروبا الوسطى” البعوض نشرت مؤخرا9، ويصف لنا اللعاب القسري كما أفاد أندرسون وآخرون. 8 مع بعض التعديلات. يسمح هذا الأسلوب ارتفاع إنتاجية موحدة التجارب تحت شروط السلامة العالية المستوى (BSL-3)، ويتضمن تحديد الفيروس النشط بخلية الثقافة على أساس فحوصات. وتشمل التجارب الموضحة هنا 856 البعوض. وكانوا مصابين زيكف في وجبة الدم الاصطناعي وتحليلها في وقت لاحق لوجود جزيئات الفيروسات المعدية في اللعاب. اشتعلت البعوض أدخلت الشعبين تجارب شملت المختبرات عريقة Ae. مصرية و Culex pipiens بيبينس بيوتيبي موليستوس (Cx. ص موليستوس)، فضلا عن ميدان Culex بيبينس بيبينس بيوتيبي بيبينس (Cx. pipiens ص) و Culex تورينتيوم (Cx. تورينتيوم) وهما عبد اللطيف-البوبيكتوس السكان. استثناء واحد للسكان Ae. البوبيكتوس اثنين، والتي تم جمعها في إيطاليا، جمعت جميع البعوض في ألمانيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد ثبت سابقا أن النتائج التي تم الحصول عليها بالإكراه اللعاب تتماشى مع التجارب الكلاسيكية إعادة التغذية6. ومع ذلك، سواء في إعادة تغذية التجارب أو في طريقة عرض من اللعاب القسري، من المستحيل مباشرة دليل على نشاط اللعاب أو رصد إطلاق سراح اللعاب. لإثبات النشاط اللعاب، يمكن أن تختبر عينات لمكونات أخرى موجودة في اللعاب (على سبيل المثال-، البروتينات، الكربوهيدرات، إلخ.). وعلاوة على ذلك، سيسمح قبكرس إضافية الكشف عن نسخ الرنا الفيروسي. ومع ذلك، وهذا يتطلب تقسيم عينات اللعاب لتحليلات مختلفة، مما قد يحد من حساسية في مقايسة ثقافة الخلية في حالة إعداد الجسيمات منخفضة جداً. بدوره، وهذا قد يؤدي إلى التقليل من معدلات انتقال العزم.
للنتائج استنساخه، من الضروري ضمان أن جميع البعوض البقاء على قيد الحياة حتى نهاية التجربة. ويسيطر هذا بصريا رصد نشاط حركة الجسم من البعوض. وعلاوة على ذلك، قد استخدام مبدأ المقايسة اللعاب لنوع معين من البعوض لفحصها عن طريق تغذية مراقبة الفيروسات والتي هي معروفة لإرسالها عن طريق هذه الأنواع من البعوض محددة. العكس بالعكس، قد كل الفيروسات التي أدخلت في تجربة اختبار في البعوض عرضه.
فحوصات اللعاب القسري لها العديد من المزايا. يمكن اختبار إعداد كبيرة من البعوض في وقت واحد على عينة واحدة قاعدة تحت ظروف خاضعة للرقابة الموحدة دون المتعارضة مع أنظمة رعاية الحيوان9.
الأسلوب الذي يستخدمه عدة مختبرات. ومع ذلك، قد تختلف الأجهزة الدقيقة، التي يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في النتائج بين المختبرات. هو أحد المكونات الهامة الشعرية لجمع اللعاب، التي يمكن أن تكون مصنوعة من الزجاج14 أو15من البلاستيك. للامتثال للوائح السلامة العالية من إينسيكتاري المستوى 3 السلامة الأحيائية، استخدمنا البلاستيك تصفية نصائح بدلاً من الزجاج الشعيرات الدموية، وبالتالي تقليل مخاطر الإصابات. وعلاوة على ذلك، نصائح تصفية لها ميزة أن السائل التي تم جمعها يمكن بسهولة نقلها باستخدام ماصة.
ويستند الإعداد لفحص اللعاب القسري المقدمة هنا اثنين من المحققين العمل معا وتقاسم الواجبات. يتم تسريح من البعوض بشخص واحد، بينما الآخر في نفس الوقت تستعد الإعداد اللعاب القسري. هذا يقلل من الوقت المناولة إلى حد كبير، ويقلل من الخطر من عينة التبديل كتغيير بين التسريح-أماكن العمل واللعاب-اللوحة ليست ضرورية. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح وضع البعوض على جهاز اللعاب القسري فورا بعد التسريح. هذا البعوض قصيرة بدلاً من التعامل مع الوقت أمر ضروري لنجاح اللعاب القسري. وأخيراً، يمكن رصد البعوض مباشرة للحركة في جميع أنحاء التجربة كلها.
فحص اللعاب المقدمة هنا تستخدم لاكتساب نظرة ثاقبة إمكانات متجه من أنواع البعوض. بيد للإجابة على بعض الأسئلة المحددة الأخرى (على سبيل المثال.، عدد لدغات البعوض التي هي بحاجة لتصيب الفقاريات)، والحيوانات التجارب قد تكون مطلوبة.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر إيلا وينيرت، هيلمز ميشيل وبادوش مارليس للمساعدة التقنية الممتازة، جيسيكا Börstler لإجراء تحليلات للبعوض Culex ، نوربرت بيكر وبيورن بلوسكوتا لتوفير البيض Aedes albopictus وفابالاهتي قوللي توفير مخزون الفيروس. مل تدعمها “الرابطة لايبنتز”؛ منح رقم شهد-2014-SGN-3.
Materials
| Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
| Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
| Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
| Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
| Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
| Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
| Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
| Vero cells | BNITM | ||
| Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
| double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
| Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
| RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
| MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
| Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
| filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
| hand motor mixer | carl roth | sold out | |
| micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
| DMEM | P0403550 | ||
| L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
| Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
| Fructose | carl roth | 4981.5 | |
| Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
| FBS | PAN | ||
| Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
| MEM NAA | PAN | P0832100 | |
| Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
| Light Cycler | Roche | 480 II | |
| Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
| Modeling clay | no specific provider | ||
| King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
| Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
| Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
| Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
| CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |
Referenzen
- Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).
- Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus. Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).
- Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 102-108 (2008).
- Cornel, A. J., Jupp, P. G. Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses. Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).
- Hurlbut, H. S. Mosquito salivation and virus transmission. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).
- Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes. Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).
- Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe. Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).
- Hierholzer, J. C., Killington, R. A. . Virus Isolation and Quantitation – Virology methods manual. , (1996).
- Horzinek, R. W., Marian, C. Kompendium der allgemeinen Virologie. Zentralblatt für Veterinärmedizin R A. 32 (1-10), 480 (2010).
- Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -. M. Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).
- Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus. Parasites & Vectors. 8, 463 (2015).
- Weger-Lucarelli, J., Rückert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., Turell, M. J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), (2016).
- Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -. B. Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection. PLOS ONE. 4 (6), e5895 (2009).
