Análise dos N- glicanos de Raphanus sativus cultivares usando PNGase H⁺

Os N– glicanos em plantas têm chamado a atenção crescente nos últimos anos, como pesquisas anteriores destacou os N– glicanos como uma fonte potencial de reacções imunológicas que podem provocar respostas alérgicas^1,2 . Foi demonstrado anteriormente que os N– glicanos em glicoproteínas de planta pode afetar a atividade catalítica de^3,4, estabilidade térmica e dobramento^5,6 ou Localização subcellular e secreção⁷. A fim de correlacionar as estruturas glicano com suas respectivas funções, os N– glicanos deve ser lançados de glicoproteínas ou quimicamente ou enzimaticamente. O método químico clássico para liberar N– e O– os glicanos é β-eliminação, em que o tratamento alcalino amostra é acompanhado por redução com borohidreto para produzir um alditol⁸. No entanto, este procedimento impede a rotulagem com um fluoróforo e causa deterioração significativa de unidades de monossacarídeo do redutor final da estrutura de glicano. Deglycosylation química, com base no tratamento de hidróxido de amônio/carbonato é também um método alternativo comumente usado⁹. Nenhum desses métodos de liberação química degrada proteínas intactas, que permite a análise de espectrometria de massa de glicano sem rótulo piscinas sem a interferência de fragmentos de peptídeo na mesma faixa de massa. No entanto, um inconveniente desses métodos é a taxa de aumento da degradação de α1, 3-fucosilado N– os glicanos, uma estrutura comum de carboidrato encontrado em plantas,¹⁰. Como alternativa, os métodos de liberação enzimática usando peptídeo:N– glycanases (PNGases, CE 3.5.1.52) são também amplamente aplicados. Recombinante PNGase F (de Flavobacterium meningosepticum) é a escolha mais comum e permite a libertação de todos os tipos de N– os glicanos, exceto as estruturas portadoras de um núcleo α1, fucose 3^11,12. Portanto, A PNGase (isoladas de sementes amêndoas) geralmente é usada para a análise da planta Nos glicanos –¹³. No entanto, esta enzima deglycosylates apenas proteoliticamente-derivado glicopeptídeos e é incapaz de deglycosylate nativo glicoproteínas¹⁴. Portanto, um exame de amostra de várias etapas é necessário antes de mais análise, que provoca a perda extensa dos glicanos, especialmente aqueles de baixa abundância¹⁵. O objetivo geral do método é apresentar um fluxo de trabalho otimizado para N– glicano liberação e rotulagem de forma simples e robusta de fluorescência. A lógica subjacente é que o PNGase H⁺, que recentemente foi descoberto em Terriglobus roseus e pode ser expressa de recombinantes em e. coli, pode hidrolisar os N– glicanos diretamente do andaime proteína em ácido condições de¹⁶. A principal vantagem de usar PNGase H⁺ sobre métodos alternativos é que reações de rotulagem fluorescentes podem ser executadas em tubo de reação mesmo sem alterar a reação amortecedores^17,18. As condições de preparação simples e alta recuperação de oligossacarídeos de baixo-abundância fazem esse método uma ferramenta valiosa na análise do N– os glicanos. Este protocolo é apropriado para a análise de N– os glicanos de várias espécies de plantas.