Drosophila larva termal tercihlerini belirlemek için bir sıcaklık gradyanı tahlil
Summary
Burada, Drosophila larva sürekli termal degrade kullanarak tercih edilen ortam sıcaklığında belirlemek için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Meyve sineği Drosophila melanogaster, dahil olmak üzere birçok hayvan onların tercih edilen termal manzara aramaya sağlayan çevre sıcaklığı, ayrımcılık dakika farklılıklar yeteneğine sahiptirler. Larva sıcaklık tercihleri üzerinde tanımlanmış bir doğrusal Aralık tanımlamak için biz bir sıcaklık gradyanı kullanarak bir tahlil geliştirilmiştir. Bir tek yönlü eğim kurmak için iki Alüminyum blok her biri bireysel blok sıcaklığını denetler bağımsız su hamama bağlanır. İki blok geçişin alt ve üst sınırlarını ayarlayın. Sıcaklık gradyanı plaka aralarındaki uzaklığı kapsaması su kontrollü iki blok ötede bir özel kaplamalı alüminyum levha koyarak kurulur. Su blok üst kısmında ayarlanır alüminyum plaka uçları minimum ve maksimum sıcaklık tanımlar ve bölgeler arasında doğrusal bir sıcaklık gradyanı iki blok oluştururlar. Degrade tahlil farklı yaş larva için uygulanabilir ve mutasyonlar TRP kanalları ve sıcaklık ayrımcılık için gerekli olan opsins, kodlama genler etkileyen olanlar gibi fenotipleri sergi mutantlar tanımlamak için kullanılan.
Introduction
Thermotaxis hareket eden hayvanlar tarafından en uygun koşulları1,2,3bir ortam seçmek için istihdam edilmektedir. Eğer iklim aşırı sıcak veya soğuk, bu davranış yaşam için hayati önem taşımaktadır. Buna ek olarak, birçok hayvan çok küçük rahat aralığında sıcaklık farklılıkları duyarlıdır ve çevresi ile ideal bir sıcaklık ararlar. Bu onların vücut ısısı çevre ile equilibrate meyve sinekleri gibi poikilothermic organizmalar için belirli önem taşıyor. Larva thermotaxis izlemek için deneyleri ve moleküler sensörler Drosophila geçici potansiyel reseptör (TRP) kanalları4,5,6gibi rolleri açıklığa kavuşturulması enstrümantal oldunuz. rhodopsins7,8ve ionotropic reseptör reseptörleri (IRS)9, hangi sıcaklık hassasiyeti ile bu hayvanların farklı sıcaklık aralıklarında bağışlamak.
Bir iki yönlü seçim test termal larvaları6,7tercihlerinde çalışmaya bir yaklaşım sağlar. Tahlil iki farklı sıcaklık bölgeleri kurulması üzerine kuruludur ve hayvanlar üzerinde başka bir tarafı seçmek izin verir. Çift yönlü seçenek test sonuçlarından sağlam, özellikle sıcaklık iki seçenek arasında büyük farklar olabilir. Her tahlil sadece iki grup tabulating gerektirdiğinden, buna ek olarak, verileri bir basit tercih dizin olarak ifade edilebilir. Rahatlık ve kolaylık-in iki yönlü seçim deneyleri de genetik ekranlara mükellef bulunmaktadır. Ancak, büyük bir sınırlama birçok deney vahşi-türü veya mutant hayvanlar tercih edilen sıcaklığını kurmak için gerekli olmasıdır.
Degrade bir tahlil tercih edilen sıcaklık tek tahlil8‘ kurmak için bir fırsat sunuyor. Ayrıca, iki yönlü seçim test farklı olarak, bu hayvan, bir grup dağılımı değerlendirilmesi sıcaklıklar sürekli bir dizi ile karşı karşıya izin verir. Bir degrade tahlil bir petri ve tek hayvan kullanır ve bireysel hayvanlar10ayrıntılı davranışını karakterize için uygundur. Ancak, Petri yemekler yuvarlak olduğundan, sıcaklık bölgeleri boyutları değişir ve Merkezi’nden mesafeye göre aşamalı olarak daha küçüktür. Bu nedenle, bu kurulum nüfus hayvanların sıcaklığı seçimleri izlemek için ideal değildir.
Larva grupları sıcaklık tercihlerini değerlendirmek için uygundur sürekli bir termal degrade aparatı ve dikdörtgen bir arena istihdam burada açıklanmıştır. Aparatı oluşturmak ve montajı kolaydır. Buna ek olarak, gradyandaki doğrusal ve 42 ° C. 10 ° C arasında büyük sıcaklık aralıkları üzerinden thermotaxis değerlendirmek için kullanılabilir gibi esnektir Tahlil hızlı ve doğru sözlü gerçekleştirmek ve tekrarlanabilir veri verir. Larva tercih sıcaklığını raporlama yanı sıra, hayvan nüfusu tercihleri tek bir deneyde bir tüm doğrusal aralığında ortaya çıkarır. Bu avantajlar nedeniyle thermotaxis için gerekli genler tanımlamak için mükemmel bir seçimdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolü başarılı olmasını sağlamak için larva deneyler yapmak için yeterli sayıda elde etmek için ilgili adımları uygulamak önemlidir. Bu Maya tüpler için 2-3 yumurta atarken geliştirmek d Yapıştır içeren sinekli ön besleme içerir. Şişeleri su şişeleri içeren bir tepsiye yerleştirilir ve gıda nem korur ve etkili tarafından larvaları besleme iken normal koyu döngüleri maruz izin teşvik şeffaf plastik bir torbaya alınmış gerekir. Ancak, Maya Yapıştır sinekler tuzak haline çok…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.M. (DC007864, DC016278) NIDCD (EY008117, EY010852), NEI fon tarafından desteklenmektedir ve NIAID (1DP1AI124453).
Materials
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
Referenzen
- Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
- Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
- Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
- Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
- Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: a laboratory handbook. , (2005).
