Summary

Un'analisi di gradiente di temperatura per determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila

Published: June 25, 2018
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per determinare la temperatura ambientale preferita delle larve di Drosophila utilizzando un gradiente termico continuo.

Abstract

Molti animali, tra cui la Mosca della frutta, Drosophila melanogaster, sono in grado di discriminare minuscole differenze nella temperatura ambientale, che permette loro di cercare il loro paesaggio termale preferito. Per definire le preferenze di temperatura delle larve in un definito intervallo lineare, abbiamo sviluppato un’analisi usando un gradiente di temperatura. Per stabilire un gradiente di singolo-direzionale, due blocchi di alluminio sono collegati ai bagni di acqua indipendenti, ognuno dei quali controlla la temperatura dei singoli blocchi. I due blocchi impostare i limiti superiori e inferiori della sfumatura. Il gradiente di temperatura viene stabilito dall’immissione una piastra di alluminio rivestite su agarosio sopra i due blocchi d’acqua controllato in modo che la piastra si estende la distanza tra di loro. Le estremità della piastra in alluminio che è situato in cima ai blocchi d’acqua definisce le temperature minime e massime, e le regioni-tra i due blocchi formano una sfumatura lineare di temperatura. Il dosaggio di sfumato può essere applicato alle larve di diversa età e può essere utilizzato per identificare i mutanti che presentano fenotipi, come quelli con mutazioni a carico di geni che codificano per canali TRP e opsine, che sono necessari per la discriminazione di temperatura.

Introduction

Termotassi sono impiegato dagli animali mobili per selezionare un ambiente con condizioni più favorevoli1,2,3. Se il clima è troppo caldo o troppo freddo, questo comportamento è vitale per la sopravvivenza. Inoltre, molti animali sono sensibili alle differenze molto piccole di temperatura nella gamma confortevole e cercano un ambiente con una temperatura ideale. Questo è di particolare importanza per gli organismi pecilotermi come mosche della frutta, che equilibrare la loro temperatura corporea con l’ambiente. Saggi per monitorare termotassi larvali sono stati strumentali nell’individuare e chiarire i ruoli di sensori molecolari come Drosophila transitoria potenziale del ricevitore (TRP) canali4,5,6, Rhodopsins7,8e ionotropici recettore recettori (IRs)9, che dotare questi animali con le sensibilità di temperatura negli intervalli di temperatura diversi.

Un test a scelta a due vie fornisce un approccio per lo studio termiche preferenze in larve6,7. L’analisi comporta che istituisce due zone di temperatura distinte e permette agli animali di selezionare un lato rispetto a altro. I risultati dalle prove di scelta bidirezionale possono essere robusti, soprattutto se le differenze di temperatura tra le due opzioni sono grandi. Inoltre, poiché ogni dosaggio comporta tabulando solo due gruppi, i dati possono essere espresso come un indice semplice preferenza. La facilità e la semplicità di analisi scelta bidirezionale sono anche suscettibili di schermi genetici. Tuttavia, una limitazione importante è che molti esperimenti sono necessari per stabilire la temperatura preferita degli animali wild-type o mutanti.

Un’analisi di gradiente offre la possibilità di stabilire la temperatura preferita in una sola analisi8. Inoltre, a differenza del test a scelta a due vie, permette la valutazione della distribuzione di un gruppo di animali, quando si confronta con una serie continua di temperature. Un gradiente test utilizza una capsula di Petri e singoli animali ed è adatto per caratterizzare il comportamento dettagliato dei singoli animali10. Tuttavia, poiché le capsule di Petri sono rotondi, le dimensioni delle zone di temperatura variano e sono progressivamente più piccole a seconda della distanza dal centro. Pertanto, questa configurazione non è ideale per monitorare le selezioni di temperatura delle popolazioni di animali.

Un apparato di gradiente termico continuo che ben si adatta per valutare le preferenze di temperatura dei gruppi delle larve impiega un’arena rettangolare ed è descritto qui. L’apparato è semplice da costruire e assemblare. Inoltre, la sfumatura è lineare ed è flessibile in quanto può essere utilizzato per valutare la termotassi sopra ampi range di temperatura da 10 ° C a 42 ° C. Il dosaggio è rapido e semplice da eseguire e produce dati riproducibili. Oltre a segnalare la temperatura favorita delle larve, rivela le preferenze della popolazione degli animali nel corso di un’intera gamma lineare in un singolo esperimento. A causa di questi vantaggi, è una scelta eccellente per l’identificazione dei geni richiesti per la termotassi.

Protocol

1. le attrezzature fabbricazione e montaggio apparecchi per analisi di gradienti Fabbricare le piastre di dosaggio di alluminio per il dosaggio di gradiente unidirezionale. Tagliare e frantumare ogni piatto di dosaggio di alluminio (Figura 1A) da un unico pezzo di alluminio utilizzando una sega a nastro e taglienti mulino verticale con le seguenti dimensioni: la dimensione esterna è 140 x 100 x 9 mm e la dimensione interna è 130 x 90 x 8 mm (Figura 1B…

Representative Results

Per stabilire un singolo 18 ° C – 28 ° C-direzionale gradienti, abbiamo impostato le temperature dei due bagni a 16,8 ° C e 31 ° C. Otteniamo le temperature a 13 punti misurando la temperatura a 26 posizioni all’interno di porzioni superiore ed inferiore di tutte le 6 zone, le linee di confine tra le zone e alle estremità della superficie del gel di agarosio (Figura 2, 2E). La distribuzione di temperatura lungo il gradiente era quasi lin…

Discussion

Per garantire il successo di questo protocollo, è importante adottare misure per ottenere un numero adeguato di larve per eseguire gli esperimenti. Questi includono pre-alimentazione le mosche in flaconcini contenenti pasta di lievito per 2-3 d migliorare la deposizione delle uova. I flaconcini devono essere collocati in una vaschetta contenente acqua fiale e racchiuso in un sacchetto di plastica trasparente, che mantiene l’umidità del cibo e promuove l’alimentazione efficace dalle larve permettendo l’esposizione a cic…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

C.M. è supportato da finanziamenti da nia (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) e il NIAID (1DP1AI124453).

Materials

Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath Thomas Scientific 9106 This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient) Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient) 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing McMaster-Carr 91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing Tygon 57296 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name Company Catalog Number Comments
Items and reagents for assay
Pestle USA Scientific 17361 Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer Fluke 51II
Thermocouple Fluke K type
Universal microplate lid Corning 6980A77
35 mm dish Corning 9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient) Fisher Scientific 15-951 Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose Invitrogen 16500500 Prepare 1% solution
Sucrose Sigma S0389-5KG Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush Fisher Scientific 11860
50 mL centrifuge tubes Denville C1062-P
Scoopula Fisher Scientific 14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle Pyrex 1395-500
Cell strainer (300 mm pore) PluriSelect 43-50300 Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray) Genesee Scientific FS32-124
Name Company Catalog Number Comments
Drosophila food
Distilled water 22,400 mL
Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg LabScientific Inc. NC0535320 1,609 g
Brewers yeast 100 lbs MP Biomedicals ICN90331280 379 g
NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) Genesee Scientific 62-115 221 g
Drosophila Agar, Type II (5 kg) Genesee Scientific 66-103 190 g
Karo light corn syrup Karo 1,700 mL
Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) Sigma Aldrich H5501-5KG 72 g/240 mL
Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) Sigma Aldrich 81910-1 L 108 mL
Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O Sigma Aldrich 438081-500 mL 8.5 mL

Referenzen

  1. Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
  2. Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
  3. Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
  4. Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
  5. Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
  6. Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
  7. Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
  8. Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
  9. Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
  10. Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
  11. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: a laboratory handbook. , (2005).

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Diesen Artikel zitieren
Liu, J., Sokabe, T., Montell, C. A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (136), e57963, doi:10.3791/57963 (2018).

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