Geleneksel insan Pluripotent kök hücreler kimyasal Reversion için geliştirilmiş Multilineage farklılaşma potansiyeli ile saf gibi devlet
Summary
Biz, toplu, verimli ve hızlı kimyasal reversion lineage astarlanmalıdır geleneksel insan pluripotent kök hücre (hPSC) bir epigenomically-kararlı saf Preimplantasyon epiblast benzeri pluripotent devlet için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem düşük lineage astarlanmalıdır gen ekspresyonu ve yönettiği multilineage ayrımında belirgin iyileşme geleneksel hPSC satırları arasında geniş bir repertuar sonuçlanır.
Abstract
Saf insan pluripotent kök hücreleri (N-hPSC) ile gelişmiş bir işlevsellik rejeneratif tıp alanında geniş bir etkisi olabilir. Bu iletişim kuralı, verimli bir şekilde lineage astarlanmalıdır, geleneksel insan pluripotent kök hücreler (hPSC) saf benzeri pluripotency için besleyici-Alerjik ya da besleyici bağımlı koşulları ile gelişmiş işlevsellik tutulan dönmek için hedeftir. Klasik lösemi inhibitör faktörü (LIF), GSK3β, bu kimyasal saf reversion yöntemi kullanır ve yalnızca bir tankyrase inhibitörü XAV939 ile desteklenmiş MEK/ERK inhibisyon kokteyl (LIF-2i), (LIF-3i). LIF-3i benimseyerek biyokimyasal, transkripsiyon bir istikrarlı pluripotent devlet ve insan pre-implantasyon epiblast epigenetik özellikleri geleneksel hPSC döner. Bu LIF-3i yöntemi en az hücre kültür manipülasyon gerektirir ve son derece geniş insan embriyonik kök hücre (hESC) ve transgene içermeyen insan indüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC) hatları repertuarında tekrarlanabilir. LIF-3i yöntemi farklılaşma önce yeniden astar bir adım gerekli değildir; N-hPSC doğrudan son derece yüksek verimlilik ile Ayrıştırılan ve karyotip korumak ve epigenomic stabiliteleri (baskılı loci dahil olmak üzere). Yöntem evrenselliğini artırmak için geleneksel hPSC ilk kültürlü protein kinaz (forskolin) ve (LIF-5I) sinyal sonic kirpi (SUS) (purmorphamine) kazara iki ek küçük moleküller ile desteklenmiş LIF-3i kokteyl içinde. Bu kısa LIF-5i adaptasyon adım önemli ölçüde geleneksel hPSC ilk klonal genişlemesi geliştirir ve onları daha sonra saf-döndürülmesi ile LIF-böylece malzeme çekme/subcloning nadir N-hPSC gerek obviating 3i toplu miktarlarda yalnız olmak izin verir koloniler daha sonra. LIF 5i stabilize hPSCs daha sonra anti-apoptotik molekülleri gerek olmadan tek başına LIF-3i içinde korunur. En önemlisi, LIF-3i reversion belirgin geleneksel hPSC geniş bir repertuar fonksiyonel pluripotency kendi soy astarlanmalıdır gen ekspresyonu azalan ve yönlendirilmiş farklılaşma Interline değişkenliği sık silme geliştirir bağımsız hPSC satırları arasında görülmektedir. Temsilcisi karakterizasyonu LIF 3i döndürülmesi N-hPSC, isogenic hPSC fonksiyonel karşılaştırmalar için sağlanan ve deneysel stratejiler lineage astarlanmalıdır vsvardır. saf gibi Birleşik özetlenmiştir.
Introduction
2i (MEK/ERK ve GSK3β inhibitörü) kültür sistemi ilk türdeş olmayan serum tabanlı fare embriyonik kök hücreler (mESC) kültürleri pluripotency fare Preimplantasyon epiblast1benzer bir Tekdüzen yer durumunu iyileştirmek için geliştirilmiştir. Ancak, 2i insan pluripotent kök hücre (hPSC) hatları2istikrarlı bakım desteklemez. Çeşitli karmaşık küçük molekül, büyüme faktörü-takıma ve transgenik yaklaşımlar son zamanlarda putatively yakalama bildirilmiştir benzer insan saf benzeri pluripotent moleküler Devletler2. Ancak, çoğu da bu yöntemler ile oluşturulan “saf gibi” Birleşik karyotip istikrarsızlık, epigenomic defektleri (Örneğin, genel kaybı ebeveyn genomik basma) sergilenen veya farklılaşma potansiyeli Engelli.
İçinde karşıtlık, GSK3β, ERK ve tankyrase sinyal Üçlü kimyasal inhibisyonu kokteyl ve lösemi inhibitör faktörü (LIF-3i) geleneksel hPSC hatları3geniş bir repertuar istikrarlı saf benzeri reversion için yeterli. LIF 3i döndürülmesi saf hPSC (N-hPSC) normal karyotypes muhafaza ve onların ifadeleri saf özel insan Preimplantasyon epiblast genlerin arttı (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i de haiz reversion hPSC moleküler ve biyokimyasal özellikleri artan fosforile STAT3 sinyal, dahil mESC gibi saf pluripotency için benzersiz bir dizi ile azalmıştır ERK fosforilasyon, küresel 5-metilsitozin CpG hypomethylation, genom çapında KSY demethylation, embriyonik kök hücre (ESC)-belirli bir gen rehberleri ve baskın distal OCT4 artırıcı kullanımı. Ayrıca, ile karşılaştırıldığında diğer saf aberrantly hypomethylated sonuçlandı reversion yöntemleri genomik loci baskılı, LIF 3i döndürülmesi N-hPSC edildi sistematik baskılı CpG desen veya kaybı DNA metiltransferaz ifade yoksun (Örneğin, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
Geleneksel insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSC) büyümek besleyiciler ya da E8 besleyici-Alerjik koşulları üzerinde geniş bir dizi doğrudan LIF-3i kültürünün hızlı ve dökme reversion için saf epiblast gibi devlet elde. Ancak, doğrudan LIF-3i saf reversion bazı kararsız geleneksel hPSC hatları genetik olarak farklı donör kökenden gelen doğan içsel genomik ve soy astarlanmalıdır variabilities nedeniyle verimsiz olabilir.
Böylece, belgili tanımlık yarar LIF-3i yönteminin genişletmek için kademeli optimizasyonu geliştirilmiş ve burada, sunulan bu evrensel saf reversion neredeyse herhangi bir geleneksel hESC veya hiPSC transgene içermeyen satır Fiderler, fazla yükleyiciler kültürlü sağlar. Protein kinaz (forskolin) ve sonic kirpi (SUS) (kazara iki ek küçük moleküller (LIF-5I) LIF-3i kokteylle takviyeleri geleneksel hPSC geçici ilk kültür adımda bu universalized saf reversion yöntemi kullanır purmorphamine) işaret. Geleneksel hPSC LIF-5i bir ilk geçiş onları sonraki kararlı LIF-3i reversion toplu miktarlarda uyum sağlar. İlk LIF-5i adaptasyon geleneksel hPSC E8 veya besleyiciler (önce onların sonraki kararlı, sürekli pasajda LIF-3i yalnız) yetişen ilk tek hücre klonal çoğalması önemli ölçüde artırmaktadır. Geleneksel hPSC satırları adapte ilk LIF-5i bir pasajda için sonraki toplu klonal saf yeniden dönmek hücre LIF-3i koşullarında hangi malzeme çekme ve nadir istikrarlı kolonileri ya da rutin kullanımı subcloning gereğini namussuz passaging tahammül Anti-apoptotik molekülleri veya Rho ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörleri.
LIF-3i yöntemi başarıyla stabil genişletmek ve geniş bir repertuar korumak için istihdam edilmiştir > 30 bağımsız, genetik olarak farklı geleneksel hPSC hatlarında > 10-30 pasajlar ya enzimatik olmayan veya enzimatik ayrılma yöntemleri kullanarak ve İndüksiyon kromozom kanıtı olmadan veya epigenomic anormallikleri, baskılı gen loci, anormallikler de dahil olmak üzere. Ayrıca, sıralı LIF-5i/LIF-3i kültür kendi soy astarlanmalıdır gen ekspresyonu azaltarak geleneksel hPSC satırları geniş bir repertuar fonksiyonel pluripotency artıran şu ana kadar bildirilmiştir tek saf reversion yöntemidir ve büyük ölçüde onların multipotent farklılaşma potansiyeli geliştirmek. LIF-3i saf reversion yöntemi siler doğasında lineage astarlanmalıdır, geleneksel hPSC satırları farklılaşma değişkenliği Interline ve hücresel tedavi ve rejeneratif tıp uygulamasında a büyük yarar olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
LIF-3i sistem klasik fare 2i saf reversion kokteyl1 değiştirilmiş bir sürümü insan pluripotent kök hücreler için geçerlidir. (Hangi 2i yalnız genişletilemiyor) hPSC kendini yenileme LIF-2i içinde bu kokteyl ile tankyrase inhibitörü XAV939 ilave olarak stabil. LIF-3i kültür toplu ve geleneksel hPSC verimli reversion için insan Preimplantasyon epiblast3benzeyen bir pluripotent devlet sağlar. Her ne kadar hPSC XAV939 eylem o…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser hibe NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Yenilik Ödülü, Maryland kök hücre araştırma fonu (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk bilim Forum Ödülü ve Moseley Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |
Referenzen
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
- Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
- Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203 (2014).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838 (2012).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
- Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
- Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
- Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
- Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
- Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
- Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
- Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
- Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
- Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
- Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
