El sistema de cultivo 2i (inhibidor de la MEK/ERK y GSK3β) fue desarrollado originalmente para refinar las culturas de las células madre embrionarias (mESC) heterogéneos basados en suero del ratón a un estado uniforme de pluripotencialidad similar al epiblasto preimplantacional de ratón¹. Sin embargo, 2i no es compatible con el mantenimiento estable de humanas pluripotentes células madre (hPSC) líneas². Los distintos compleja molécula pequeña, suplementada con factor de crecimiento y enfoques transgénicos se han divulgado recientemente para capturar supuestamente similar ingenua-como pluripotent humana molecular Estados². Sin embargo, muchos de los Estados “ingenua-como” creados con estos métodos también exhibieron inestabilidad cariotípica, epigenómica defectos (por ejemplo, pérdida global de impresión genómica parental), o con problemas potenciales de diferenciación.

En contraste, el cóctel de triple inhibición química de la GSK3β, ERK y tankirasa señalización y factor inhibidor de leucemia (LIF-3i) era suficiente para la reversión estable de ingenua-como de un amplio repertorio de hPSC convencionales líneas³. LIF-3i-vuelto ingenuo hPSC (N-hPSC) mantiene los karyotypes normales y aumentado sus expresiones de genes específicos de ingenuo humano preimplantacional epiblasto (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i reversión también conferida hPSC con una serie de características moleculares y bioquímicas únicas a pluripotencia mESC-como ingenua que incluyó mayor señalización de STAT3 fosforilados, disminución de la fosforilación de ERK, global de 5-METILCITOSINA CpG La hipometilación, desmetilación de CpG de genoma en células madre embrionarias (ESC)-promotores de genes específicos y el uso de potenciador de OCT4 distal dominante. Además, en comparación con otros ingenuos métodos de reversión que aberrantemente hypomethylated imprimieron loci genómicos, revertido por LIF-3i N-hPSC fueron sin pérdida sistemática de patrones de CpG impresos ni pérdida de expresión de ADN metiltransferasa (por ejemplo, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)³.

Una cultura de LIF-3i directa de una amplia gama de células de vástago embrionarias humanas convencionales (hESC) y células de madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSC) crecidas en comederos o en condiciones libres de alimentador de E8 logra reversión rápida y a granel a un ingenuo epiblasto-como estado. Sin embargo, directo LIF-3i ingenuo reversión puede ser ineficaz en algunas líneas de hPSC convencional inestable debido a las inherentes variabilidades genómicas y linaje preparado derivados de los fondos de donantes genéticamente diversas.

Así, para ampliar la utilidad del método LIF-3i, una optimización paso a paso fue desarrollada y se presenta en este documento, que permite la reversión ingenuo universal con casi cualquier hESCs convencional o libre de transgén hiPSC línea cultivados en alimentadores. Este método de reversión del ingenuo universalizado emplea un paso de la cultura inicial transitoria en hPSC convencional que complementa el cóctel de LIF-3i con dos adicionales pequeñas moléculas (LIF-5i) que potencian la proteína quinasa (Forskolina) y (sonic hedgehog (sHH) señalización de purmorphamine). Un paso inicial de hPSC convencional en LIF-5i adapta a posterior reversión de LIF-3i estable en grandes cantidades. Adaptación de LIF-5i inicial aumenta significativamente la proliferación clonal de la célula inicial de hPSC convencional en E8 o alimentadores (antes de su paso posterior estable, continuo en LIF-3i solo). Líneas convencionales hPSC adaptadas primero a un pasaje de LIF-5i toleran posterior a granel clonal pases de ingenuo revertir células en condiciones de LIF-3i, que evita la necesidad de escoger y subcloning de las colonias estables raras, o el uso rutinario de moléculas anti-apoptóticas o los inhibidores de la proteína Rho quinasa (ROCK).

El método LIF-3i ha sido empleado con éxito para ampliar estable y mantener un amplio repertorio de > 30 hPSC convencional independiente, genéticamente diversas líneas para > 10 – 30 pasos utilizando cualquiera de los dos métodos de disociación enzimática o no enzimática, y sin evidencia de inducción de cromosómicas o anomalías epigenómica, incluyendo anormalidades en lugares geométricos del gene impreso. Además, cultura de LIF-5i/LIF-3i secuencial es el método de reversión sólo ingenuo que hasta el momento se ha reportado que mejora la pluripotencia funcional de un amplio repertorio de líneas convencionales hPSC disminuyendo su expresión del linaje cebada gen y dramáticamente mejorar su potencia de diferenciación multipotentes. La borra de ingenuo reversión método de LIF-3i la inherente variabilidad de la diferenciación de líneas hPSC convencional, preparado por el linaje de la interlínea y tendrá una gran utilidad de aplicación en medicina regenerativa y terapias celulares.