Химическая Reversion обычных человеческих плюрипотентных стволовых клеток в наивно как состояние с более мультилинейного дифференциация потенции
Summary
Мы представляем протокол для эффективной, насыпных и быстрого химического reversion обычных линии загрунтовать человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) в epigenomically-stable наивно Предимплантационная Эпибласт как pluripotent состояние. Этот метод приводит к экспрессии генов снижение линии загрунтовать и заметное улучшение направленного дифференцирования мультилинейного через широкий репертуар обычных hPSC линий.
Abstract
Наивный человеческих плюрипотентных стволовых клеток (N-hPSC) с улучшенной функциональностью может иметь широкие последствия в регенеративной медицине. Цель настоящего Протокола заключается в эффективно восстановить родословную-контроль включён, обычных человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) поддерживается на фидер бесплатно или фидер зависимые условия для плюрипотентности наивно как с улучшенной функциональностью. Этот метод химического наивно реверсии использует классические лейкемии тормозящий фактор (LIF), GSK3β и Мек/ERK ингибирование коктейль (LIF-2i), дополнены только ингибитор tankyrase XAV939 (LIF-3i). LIF-3i будет восстановлено обычных hPSC состоянии стабильной плюрипотентных принятия биохимические, транскрипционный анализ и эпигенетических функций человека предимплантационной Эпибласт. Этот метод LIF-3i требует минимальной клетки культуры манипуляции и высокую воспроизводимость в широкий репертуар эмбриональных стволовых клеток человека (Госкомсанэпиднадзором) и линий трансген свободного человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC). LIF-3i метод не требует повторного грунтовки шаг до дифференциации; N-hPSC могут быть продифференцированы непосредственно с чрезвычайно высокой эффективности и поддерживать karyotypic и epigenomic графену (в том числе на тисненой локусов). Чтобы увеличить универсального метода, обычные hPSC впервые культивировали в коктейль LIF-3i, дополняют два дополнительных малых молекул, которые полифункциональное киназа протеина (форсколин) и Еж Соник (ТСС) (purmorphamine) сигнализации (LIF-5i). Этот краткий LIF-5i адаптации шаг значительно повышает первоначальный клоновых расширения обычных hPSC и позволяет им быть впоследствии наивно вернулась с LIF-3i только в больших количествах, таким образом устраняя необходимость комплектации/subcloning редких N-hPSC колонии позже. LIF-5i-стабилизированный hPSCs поддерживаются впоследствии в LIF-3i только без необходимости анти apoptotic молекул. Самое главное LIF-3i реверсии заметно улучшает функциональные плюрипотентности широкий репертуар обычных hPSC, уменьшив их экспрессии генов линии загрунтовать и стирание интерлайн изменчивость направленного дифференцирования обычно наблюдается среди независимых hPSC линии. Представитель характеристики LIF-3i-отменены N-hPSC условии и экспериментальных стратегий для функциональных сравнения isogenic hPSC в линии загрунтовать против. изложены наивно как государства.
Introduction
2i (Мек/ERK и GSK3β ингибитор) культуры система первоначально была разработана для уточнения гетерогенных мыши на основе сыворотки эмбриональных стволовых клеток (mESC) культуры в единой земли состояние плюрипотентности сродни мыши Предимплантационная Эпибласт1. Однако 2i не поддерживает стабильное поддержания человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) линии2. Различные сложные малые молекулы, фактор роста дополнение, трансгенных подходы недавно сообщалось и захватить предположительно аналогичные человеческих плюрипотентных наивно как молекулярные государств2. Однако многие из «наивно как» государства, созданные с помощью этих методов, также выставлены karyotypic нестабильности, epigenomic дефекты (например, глобальные потери родителей геномный импринтинг), или нарушение дифференцировки потенциал.
В контраст, коктейль тройной химическое ингибирование GSK3β, Эрк и tankyrase сигнализации и лейкемия ингибирующего фактора (LIF-3i) было достаточно для стабильной наивно как reversion широкий репертуар обычных hPSC линии3. LIF-3i-отменены наивно hPSC (N-hPSC) поддерживается нормальное получен и увеличение их выражения человека Предимплантационная Эпибласт наивно конкретных генов (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Стелла (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i реверсии также наделяет hPSC с массивом, молекулярной и биохимической характеристики, уникальные для плюрипотентности mESC как наивный, которая включала увеличилась фосфорилированных STAT3 сигнализации, уменьшилось Эрк фосфорилирование, глобальные 5-обнаружен CpG hypomethylation, геном общесистемной CpG деметилирования в эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)-конкретных генным стимуляторам и доминирующей дистальной OCT4 усилитель использования. Кроме того, по сравнению с других наивной реверсии методов, которые привели к необычно hypomethylated запечатлел геномной локусов, LIF-3i-отменены N-hPSC были лишены систематического потеря тисненой CpG шаблонов или ДНК метилтрансфераза выражения (например, DNMT3B DNMT1, DNMT3A,)3.
Прямого LIF-3i культуры широкий спектр обычных человеческих эмбриональных стволовых клеток (Госкомсанэпиднадзором) и человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) выросла на кормушки или E8 фидер свободных условиях добиться быстрого и сыпучих реверсии наивно Эпибласт как государства. Однако прямого LIF-3i наивно возврат может быть неэффективным в некоторых нестабильных обычных hPSC линии из-за присущего геномных и заливают линии изменчивости, вытекающих из стола генетически различных доноров.
Таким образом, чтобы расширить утилита метода LIF-3i, ступенчатой оптимизации был разработан и представлен здесь, что позволяет универсальный наивно реверсии с почти любой обычных Госкомсанэпиднадзором или hiPSC трансген бесплатная линия культивированный на кормушки. Этот метод возврата универсального наивно использует временные первоначальной культуры шаг в обычных hPSC, которая дополняет LIF-3i коктейль с два дополнительных малых молекул (LIF-5i) которые полифункциональное киназа протеина (форсколин) и Еж Соник (ТСС) ( purmorphamine) сигнализации. Один из первоначальных прохождение обычных hPSC в LIF-5i подстраивается под их последующих стабильных реверсии LIF-3i в больших количествах. Первоначальный LIF-5i адаптации значительно увеличивает первоначальный одноклеточного клоновых распространения обычных hPSC, выращенных на E8 или питатели (до их последующего стабильного, непрерывного прохода в одиночку LIF-3i). Обычные hPSC линии адаптированы сначала один проход в LIF-5i терпеть последующих массовых клоновых пассированый наивно отменены клеток в условиях LIF-3i, который устраняет необходимость комплектации и subcloning редких стабильной колоний или рутинное применение анти apoptotic молекул или Ро связанные белка ингибитора киназы (рок).
LIF-3i метод успешно работали устойчиво расширять и поддерживать широкий репертуар > 30 независимых, генетически разнообразны обычных hPSC линии для > 10 – 30 проходов с использованием методов либо неферментативного или ферментативный диссоциации, и без доказательств индукцию хромосомных или epigenomic аномалии, включая аномалии на тисненой гена локусов. Кроме того, последовательное LIF-5i/LIF-3i культура является только наивный реверсии метод, который до настоящего времени было сообщено что улучшает функциональные плюрипотентности широкий репертуар обычных hPSC линий, уменьшив их экспрессии генов линии-контроль включён и значительное улучшение качества их Multipotent с дифференциация потенции. LIF-3i наивно реверсии метод стирает присущего интерлайн изменчивость дифференциации линии-контроль включён, обычных hPSC линий и будет иметь большой полезности применения в регенеративной медицине и клеточной терапии.
Protocol
Representative Results
Discussion
LIF-3i система применяет модифицированную версию классической мышиных 2i наивно реверсии коктейль1 до человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Самообновлению hPSC (который не может расширить в одиночку 2i) стабилизируется в LIF-2i, дополняя этот коктейль с tankyrase инги…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантов от NIH/НЭЙ (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), ОБН Штайн Innovation Award, Фонд исследований стволовых клеток Мэриленд (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Ново Нордиск науки Форум награду и Мосли фонд.
Materials
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |
Referenzen
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
- Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
- Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203 (2014).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838 (2012).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
- Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
- Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
- Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
- Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
- Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
- Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
- Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
- Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
- Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
- Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
