향상 된 Multilineage 차별화 힘으로 순진한 같은 상태로 기존의 인간의 Pluripotent 줄기 세포의 화학 귀선
Summary
선물이 epigenomically 안정 순 preimplantation epiblast 같은 만능 상태로, 대량, 효율적이 고 신속한 화학 귀선 기존의 혈통 액 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)의 대 한 프로토콜. 이 방법은 기존의 hPSC 라인의 광범위 한 레 퍼 토리에 걸쳐 감소 혈통 액 유전자 발현과 감독된 multilineage 차별화에 표시 되어 있는 개선에 발생합니다.
Abstract
순진한 인간 만능 줄기 세포 (N hPSC) 향상 된 기능 재생 의학에 다양 한 영향을 있을 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표 효율적으로 준비 하는 혈통, 기존의 인간 만능 줄기 세포 (hPSC) 향상 된 기능을 가진 순진한 같은 pluripotency에 피더 무료 또는 급지대 종속 상태에 유지 되돌릴 것입니다. 이 화학 순진한 귀선 메서드 GSK3β, 고전 백혈병 금지 요인 (LIF), 고용 및 MEK/ERK 저해 칵테일 (LIF-2i)는 tankyrase 억제제 XAV939만 보충 (LIF-3i). LIF 3i 안정적인 만능 주 생화학, transcriptional, 채택 및 인간의 사전 주입 epiblast의 후 성적인 기능에 기존의 hPSC 되돌립니다. 이 LIF 3i 메서드가 필요 최소한의 셀 문화 조작 하며 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 transgene 무료 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 라인의 광범위 한 레 퍼 토리에서 높은 재현성. LIF 3i 방법 차별화; 전에 다시 프라이 밍 단계를 필요 하지 않습니다. N hPSC 매우 높은 효율성과 직접 분화 될 수 있다 하 고 유지 하는 karyotypic 및 epigenomic 안정성 (찍힌된 loci에 포함). 방법의 보편성을 높이기 위해 기존의 hPSC 처음 두 개의 추가 작은 분자 단백질 키 니 아 제 (산림) 및 소닉 고슴도치 (쉿) (purmorphamine) 신호 (LIF-5i) 약효와 보충 LIF 3i 칵테일에 교양. 이 간단한 LIF 5i 적응 단계 크게 기존의 hPSC의 초기 클론 확장을 강화 하 고 그들 이후에 순진한 LIF-3i 혼자 대량 수량에 따라서 따기/subcloning 드문 N-hPSC에 대 한 필요성을 obviating와 복귀 허용 나중에 식민지입니다. LIF 5i 안정화 hPSCs 그 후에 유지 됩니다 LIF 3i 안티 apoptotic 분자의 필요 없이 혼자. 가장 중요 한 것은, LIF 3i 귀선 현저 하 게 그들의 혈통 액 유전자 발현을 감소 하 고 감독된 차별화의 인터 라인 변화를 일반적으로 지우기에 의해 기존의 hPSC의 광범위 한 레 퍼 토리의 기능 pluripotency를 향상 독립 hPSC 라인 사이 관찰. LIF 3i 돌 N-hPSC의 대표 characterizations 혈통 액 대isogenic hPSC의 기능 비교에 대 한 제공, 그리고 실험적인 전략 있습니다. 순진한 같은 상태 설명 되어 있습니다.
Introduction
2i (MEK/ERK 및 GSK3β 억제제) 문화 시스템 유형이 다른 혈 청 기반 마우스 배아 줄기 세포 (mESC) 문화 마우스 preimplantation epiblast1유사 pluripotency의 균일 한 접지 상태를 수정 하기 위해 원래 개발 되었다. 그러나, 2i는 인간 만능 줄기 세포 (hPSC) 라인2의 안정적인 유지 보수를 지원 하지 않습니다. 다양 한 성장 인자를 보충 하는 복잡 한 작은 분자와 유전자 변형 방법 최근 상 캡처 보고 된 유사한 인간의 순 같은 만능 분자 상태2. 그러나, 또한 이러한 메서드를 사용 하 여 만든 “순진한 같은” 상태 karyotypic 불안정성, epigenomic 결함 (예: 글로벌의 손실 부모의 게놈 각 인), 전시 또는 차별화 잠재적 장애인.
에 대비, GSK3β, ERK 및 tankyrase 신호 트리플 화학 억제의 칵테일 및 백혈병 금지 요인 (LIF-3i) 기존의 hPSC 라인3의 광범위 한 레 퍼 토리의 안정 순-같은 버전에 대 한 충분 한 했다. LIF 3i 되돌릴 순 hPSC (N hPSC) 정상적인 karyotypes를 유지 하 고 순진한 특정 인간의 preimplantation epiblast 유전자의 그들의 식을 증가 (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, 스텔라 (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). Phosphorylated STAT3 신호 증가, 포함 mESC 같은 순진한 pluripotency에 고유한 분자와 생 화 확 적인 특성의 배열과 LIF 3i 버전도 수 여 hPSC 감소 ERK 인 산화, 글로벌 5-methylcytosine 포장 소비재 hypomethylation, 배아 줄기 세포 (ESC)에서 게놈 넓은 포장 소비재 demethylation-특정 유전자 발기인, 및 지배적인 원심 OCT4 증강 사용. 또한, 다른 순진한 비해 귀착되 었 다 aberrantly hypomethylated 복귀 방법 각 게놈 loci, LIF 3i 돌 N-hPSC 찍힌된 CpG 패턴의 체계적인 손실 또는 DNA methyltransferase 식의 손실 없는 (예: DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
기존의 인간 배아 줄기 세포 (hESC)와 지류 또는 E8 급지대 무료 조건에서 자란 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)의 광범위 한 배열의 직접 LIF 3i 문화 순진한 epiblast 같은 상태로 신속 하 고 대량 귀선 달성. 그러나, 직접 LIF 3i 순진한 귀선 일부 불안정 한 기존의 hPSC 라인 고유의 게놈 및 혈통 액 variabilities 유전자 다양 한 기증자 배경에서 발생 하는 때문에 효율적인 하지 수 있습니다.
따라서, LIF 3i 메서드의 유틸리티를 확대, stepwise 최적화 개발 되었다 고 여기 제시 수 있는 거의 모든 기존의 hESC 또는 transgene 무료 hiPSC 선 보편적인 순진한 귀선 교양 모이 통에. 이 단신 순진한 귀선 메서드 사용 하 여 두 추가 작은 분자 (LIF-5i) 단백질 키 니 아 제 (산림)와 소닉 더 헤지호그 (sHH) (약효와 LIF 3i 칵테일을 보완 하는 기존의 hPSC에서 일시적인 초기 문화 단계 purmorphamine) 신호입니다. LIF 5i에 기존의 hPSC의 한 초기 통과 이후 안정적인 LIF 3i 버전 대량 수량에서을 그들을 적응 시킨다. 초기 LIF 5i 적응은 크게 E8 또는 지류 (LIF-3i 혼자에서 후속 안정적, 지속적인 통로) 이전에 성장 하는 기존의 hPSC의 초기 단일 세포 클론 증식을 증대 시킵니다. 기존의 hPSC 라인 적응 먼저 LIF 5i에 하나의 통로를 용납 이후 대량 클론 뿌리고 LIF 3i 조건에서 순진한 되돌릴 셀의 따기 및 subcloning 드문 안정적인 식민지, 또는 일상적인 사용의 필요성을 obviates는 안티-apoptotic 분자 또는 단백질으로 관련 된 키 (바위) 억제제.
LIF 3i 메서드는 성공적으로 안정적으로 확장 하 고의 광범위 한 레 퍼 토리를 유지 고용 되었습니다 > 30 독립, 유전으로 다양 한 기존의 hPSC 라인 > 10-30 구절 중 비 효소 또는 효소 분리 방법을 사용 하 여 고 염색체의 유도의 증거 없이 또는 epigenomic 이상, 찍힌된 유전자 loci에서 이상 포함 한. 또한, 순차 LIF-5i/LIF-3i 문화 유일한 순진한 복귀 방법입니다 지금까지 보고 그들의 혈통 액 유전자 발현을 감소 하 여 기존의 hPSC 라인의 광범위 한 레 퍼 토리의 기능 pluripotency를 개선 하 고 극적으로 개선 하는 그들의 multipotent 차별화 힘. 고유의 LIF 3i 순진한 복귀 방법 지웁니다 환승 혈통 액, 기존의 hPSC 라인의 차별화의 다양성 그리고 재생 의학 및 세포 치료에 응용 프로그램의 좋은 유틸리티.
Protocol
Representative Results
Discussion
LIF 3i 시스템 인간의 pluripotent 줄기 세포 클래식 murine 2i 순진한 귀선 칵테일1 의 수정된 된 버전을 적용합니다. (이 혼자 2에서 확장할 수 없습니다) hPSC의 자기 갱신 tankyrase 억제제 XAV939 함께이 칵테일을 보완 하 여 LIF-2에서 안정 이다. LIF 3i 문화 대량 인간의 preimplantation epiblast3닮은 만능 상태로 기존의 hPSC의 효율적인 복구를 수 있습니?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH/네이 (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB 스타인 혁신 상 수상는 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk 과학 포럼 상와 모 슬 리 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |
Referenzen
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
- Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
- Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203 (2014).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838 (2012).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
- Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
- Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
- Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
- Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
- Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
- Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
- Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
- Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
- Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
- Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
