Reversione chimica delle cellule staminali pluripotenti umane convenzionali a uno stato ingenuo-simile con una migliore differenziazione di Multilineage potenza
Summary
Vi presentiamo un protocollo per la reversione chimica efficiente, alla rinfusa e rapida delle cellule staminali pluripotenti umane lignaggio-innescato convenzionale (hPSC) in uno stato di preimpianto epiblasto-come pluripotenti ingenuo epigenomically-stable. Questo metodo provoca l’espressione genica in diminuzione di lignaggio-innescato e miglioramento notevole nella differenziazione multilineare diretto attraverso un vasto repertorio di hPSC convenzionali linee.
Abstract
Cellule staminali pluripotenti umane di ingenuo (N-hPSC) con funzionalità migliorate possono avere un ampio impatto nella medicina rigenerativa. L’obiettivo del presente protocollo è per ripristinare in modo efficiente le cellule staminali pluripotenti umane lignaggio-innescato, convenzionale (hPSC) mantenute su condizioni sia privo di alimentatore o Alimentatore-dipendente da un ingenuo-come pluripotenza con funzionalità migliorate. Questo metodo di reversione ingenuo chimica impiega il fattore inibitorio di leucemia classica (LIF), GSK3β e MEK/ERK inibizione cocktail (LIF-2i), completati con solo un inibitore di tankyrase XAV939 (LIF-3i). LIF-3i Ripristina hPSC convenzionale a uno stato stabile pluripotenti adottando biochimici, trascrizionale e caratteristiche epigenetiche dell’epiblasto umana pre-impianto. Questo metodo di LIF-3i richiede manipolazione di cultura di cellule minimal ed è altamente riproducibile in un vasto repertorio di cellule staminali embrionali umane (hESC) e linee di cellule staminali (hiPSC) di transgeni umane pluripotenti indotte. Il metodo di LIF-3i non richiede un passaggio ri-adescamento prima la differenziazione; N-hPSC possono essere differenziati direttamente con rendimenti estremamente elevati e mantenere karyotypic e stabilità di epigenomic (tra cui impresso loci). Per aumentare l’universalità del metodo, hPSC convenzionali sono coltivate in primo luogo nel cocktail LIF-3i completati con due altre piccole molecole che potenziare la chinasi di proteina A (forskolin) e segnalazione di sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) (LIF-5i). Questo breve passaggio di adattamento LIF-5i significativamente migliora l’iniziale espansione clonale di hPSC convenzionale e permette loro di essere successivamente ingenuo-è ritornato con LIF-3i solo allo stato sfuso, così prevenendo l’esigenza di picking/subcloning rara N-hPSC colonie più tardi. LIF-5i-stabilizzato hPSCs sono mantenute in seguito a LIF-3i da solo senza la necessità di molecole anti-apoptotico. La cosa più importante, LIF-3i reversione contrassegnato migliora la pluripotenza funzionale di un vasto repertorio convenzionale hPSC diminuendo la loro espressione genica innescata lignaggio e cancellando la variabilità di interlinea di differenziazione diretto comunemente osservato tra linee hPSC indipendente. Rappresentante caratterizzazioni di LIF-3i-reverted N-hPSC sono strategie fornite e sperimentale per comparazioni funzionale di hPSC isogeniche nel lignaggio-innescato vs. Stati di tipo ingenuo sono delineati.
Introduction
Il sistema di coltura 2i (inibitore MEK/ERK e GSK3β) è stato originariamente sviluppato per perfezionare culture di cellule staminali embrionali (mESC) eterogenei basati su siero del mouse ad uno stato di terreno uniforme di pluripotenza simile al mouse epiblast preimpianto1. Tuttavia, 2i non supporta il mantenimento stabile della pluripotenti umane della cellula formativa (hPSC) linee2. I vari complessa piccola molecola, fattore di crescita-completati e approcci transgenici recentemente sono stati segnalati per catturare putativamente simili pluripotenti umane ingenuo-come molecolare afferma2. Tuttavia, molti degli Stati “ingenuo-like” creati con questi metodi anche esibito karyotypic instabilità, epigenomic difetti (ad es., perdita globale di parental imprinting genomico), o alterata differenziazione potenziale.
In contrasto, il cocktail di tripla inibizione chimica di GSK3β, ERK e tankyrase della segnalazione e fattore inibitorio di leucemia (LIF-3i) era sufficiente per la reversione ingenuo-come stabile di un vasto repertorio di hPSC convenzionali linee3. LIF-3i-reverted ingenuo hPSC (N-hPSC) mantenuto i karyotypes normali e aumentato le loro espressioni di geni specifici ingenuo umano preimpianto epiblasto (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i hPSC di reversione conferito anche con una serie di caratteristiche molecolari e biochimiche uniche alla pluripotenza mESC-come ingenuo che comprendeva aumentata fosforilato STAT3 signaling, ha fatto diminuire la fosforilazione di ERK, global 5-metilcitosina CpG ipometilazione, demetilazione CpG genoma alle cellule staminali embrionali (ESC)-promotori di geni specifici e uso di enhancer OCT4 distale dominante. Inoltre, in confronto ad altri ingenui metodi di reversione che ha provocato aberrante ipometilato impresso loci genomici, LIF-3i-reverted N-hPSC erano privi di perdita sistematica di impresso CpG modelli o perdita di espressione di DNA metiltransferasi (per esempio, DNMT3B DNMT1, DNMT3A,)3.
Una coltura di LIF-3i diretta di una vasta gamma di convenzionale staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSC) coltivate su alimentatori o E8 privo di alimentatore condizioni raggiunto reversione alla rinfusa e rapida ad uno stato di epiblasto-come ingenuo. Tuttavia, diretto LIF-3i ingenuo reversione può essere inefficiente in alcune linee di hPSC convenzionale instabile dovuto l’inerente variabilità genomica e lignaggio-innescato derivanti dagli sfondi donatore geneticamente diverse.
Così, per ampliare l’utilità del metodo LIF-3i, un’ottimizzazione graduale è stata sviluppata ed è presentata qui, che permette di reversione ingenuo universale con quasi qualsiasi hESC convenzionale o linea di transgeni hiPSC coltivate su alimentatori. Questo metodo di reversione universalizzanti ingenuo impiega un passo di cultura iniziale transitoria in hPSC convenzionale che integrano il cocktail di LIF-3i con due altre piccole molecole (LIF-5i) che rafforzano la chinasi di proteina A (forskolin) e sonic hedgehog (sHH) ( segnalazione di purmorphamine). Un passaggio iniziale di hPSC convenzionale in LIF-5i li adatta a successive stabile LIF-3i reversione allo stato sfuso. Adattamento di LIF-5i iniziale aumenta significativamente la proliferazione clonale di singola cellula iniziale delle convenzionali hPSC coltivate su E8 o alimentatori (prima del loro successivo passaggio stabile, continuo a LIF-3i da solo). HPSC convenzionali linee adattate prima di un passaggio in LIF-5i tollerano successive alla rinfusa clonale passaggio delle cellule naive-reverted in condizioni di LIF-3i, che previene l’esigenza di picking e subcloning di rare colonie stabili, o l’uso di routine molecole anti-apoptotiche o inibitori della Rho-associati proteina chinasi (ROCK).
Il metodo di LIF-3i è stato impiegato con successo per stabile espandere e mantenere un vasto repertorio di > 30 hPSC convenzionale indipendente, geneticamente diverse linee per > 10 – 30 passaggi utilizzando sia metodi di dissociazione non enzimatica o enzimatica, e senza prova di induzione di cromosomiche o anomalie epigenomic, compreso le anomalie alle loci genici impresso. Inoltre, sequenziale LIF-5i/LIF-3i cultura è il metodo di reversione solo ingenuo che finora è stato segnalato che migliora la pluripotenza funzionale di un vasto repertorio di linee convenzionali hPSC diminuendo la loro espressione genica innescata lignaggio e migliorando notevolmente la loro potenza di differenziazione multipotenti. Il LIF-3i ingenuo reversione metodo cancella l’intrinseco interline variabilità di differenziazione delle linee hPSC lignaggio-innescato, convenzionale e avrà una grande utilità dell’applicazione nella medicina rigenerativa e terapie cellulari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema di LIF-3i si applica una versione modificata del classico 2i murino ingenuo reversione cocktail1 a cellule staminali pluripotenti umane. L’auto-rinnovamento di hPSC (che non può espandersi in 2i da solo) è stabilizzato in LIF-2i completando questo cocktail con l’inibitore di tankyrase XAV939. LIF-3i cultura permette alla rinfusa e reversione efficiente della hPSC convenzionale ad uno stato pluripotenti che assomiglia l’ epiblasto preimpianto umano<sup class="x…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH/nia (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award e la Fondazione di Moseley.
Materials
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |
Referenzen
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