לדוגמות כימיים בתאי גזע Pluripotent האנושית המקובלת למצב תמים כמו עם העוצמה התמיינות משופרת Multilineage
Summary
אנו מציגים עבור יעיל בתפזורת, מהירה כימי לדוגמות של תאי גזע pluripotent האנושי שושלת היוחסין-איפה זה מונח קונבנציונאלי (hPSC) לתוך מצב של epiblast דמוי pluripotent יציב epigenomically תמים פרוטוקול. שיטה זו התוצאה ביטוי גנים שושלת היוחסין-איפה זה מונח ירד שיפור ניכר תוך בידול multilineage מכוונת על-פני רפרטואר רחב של קווי hPSC המקובלת.
Abstract
נאיבי האדם גזע pluripotent (N-hPSC) עם פונקציונליות משופרת עשוי להיות בעל השפעה רחב של רפואה רגנרטיבית. המטרה של פרוטוקול זה היא לחזור ביעילות את שושלת היוחסין-איפה זה מונח, קונבנציונאלי האנושי גזע pluripotent (hPSC) נשמר בתנאים או ללא מזין או תלויי-מזין כדי pluripotency כמו תמימה עם פונקציונליות משופרת. שיטה זו לדוגמות תמים כימי מעסיקה את לוקמיה קלאסית מעכבות פקטור (LIF), GSK3β, וניגוד MEK/טיפשה קוקטייל (LIF-2i), בתוספת רק מעכב tankyrase XAV939 (LIF-3עכשיו). LIF-3עכשיו חוזרת hPSC המקובלת למצב יציב pluripotent אימוץ הביוכימי, תעתיק, ותכונות epigenetic של epiblast האנושי טרום השרשה. שיטה זו LIF-3עכשיו דורש תא מינימלי תרבות מניפולציה, והוא מאוד לשחזור ב רפרטואר רחב של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) וקווים תאי גזע (hiPSC) ללא transgene האנושי pluripotent המושרה. השיטה LIF-3עכשיו אינה דורשת צעד priming מחדש לפני הבידול; N-hPSC ניתן להבחין ישירות עם יעילות גבוהה מאוד ולתחזק karyotypic, stabilities epigenomic (כולל ב לוקוסים הדומיננטיות). כדי להגביר את האוניברסליות של השיטה, hPSC המקובלת מתורבתים לראשונה בקוקטייל LIF-3עכשיו בתוספת שתי מולקולות קטנות נוספות פלאטין קינאז (forskolin), סוניק הקיפוד (שקט) (purmorphamine) איתות (LIF-5i). שלב ההסתגלות LIF-5i קצר באופן משמעותי משפר הרחבה המשובטים הראשונית של hPSC קונבנציונלי ו המאפשר להם להיות לאחר מכן תמימה-להחזירה עם LIF-3עכשיו לבד בכמויות, ובכך obviating את הצורך subcloning/איסוף נדיר N-hPSC מושבות מאוחר יותר. LIF 5i-מיוצב hPSCs לאחר מכן נשמרים ב- LIF-3עכשיו לבד ללא הצורך של מולקולות אנטי-מוות. והכי חשוב, לדוגמות LIF-3עכשיו משפר בצורה ניכרת את pluripotency תפקודית של רפרטואר רחב של hPSC המקובלת על-ידי הפחתת ביטוי הגנים בשלה שושלת היוחסין שלהם ומוחקת את ההשתנות interline של התמיינות מכוונת בדרך כלל הבחינו בין השורות hPSC עצמאית. אפיוני נציג של LIF-3עכשיו-להחזירה N-hPSC הם שסופקו, ניסיוני אסטרטגיות להשוואות פונקציונלי של isogenic hPSC היוחסין-איפה זה מונח vs. תמים כמו הברית מתוארים.
Introduction
מערכת התרבות 2i (MEK/טיפשה, GSK3β מעכב) פותח במקור כדי לחדד את העכבר מבוסס-סרום הטרוגנית תרבויות בתאי גזע עובריים (mESC) למצב הקרקע אחידה של pluripotency דומה epiblast של העכבר1. עם זאת, 2i אינו תומך קיום אנושי pluripotent תאי גזע (hPSC) קווים2יציבה. מולקולה קטנה מורכבים, שיושלם פקטורי גדילה, השונים, גישות הטרנסגניים דווחו לאחרונה כדי ללכוד putatively דומה pluripotent תמים כמו האדם מולקולרית קובע2. עם זאת, רבים של הברית “תמים כמו” שנוצרו באמצעות שיטות אלה גם הציג יציבות karyotypic, epigenomic פגמים (למשל, גלובל אובדן הורים החתמה גנומית), או לקוי בידול פוטנציאליים.
ב לעומת זאת, את הקוקטייל של דיכוי כימי משולשת של GSK3β, טיפשה, tankyrase איתות, לוקמיה מעכבות פקטור (LIF-3עכשיו) היה מספיק עבור השחזור תמים כמו יציבה של רפרטואר רחב של קווים hPSC קונבנציונלי3. LIF-3עכשיו-להחזירה תמים hPSC (N-hPSC) karyotypes נורמלי ולא מוגברת שלהם ביטויים של גנים ספציפיים תמים epiblast של האדם (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, סטלה (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). HPSC לדוגמות גם הענקת LIF-3עכשיו עם מערך של הביוכימי המולקולריים מאפיינים ייחודיים ל- pluripotency כמו mESC תמים שכלל מוגברת phosphorylated STAT3 איתות, ירד טיפשה זרחון, CpG 5 העולמית-methylcytosine hypomethylation, demethylation CpG הגנום כולו-תאי גזע עובריים (ESC)-גנים ספציפיים היזמים ושימוש דומיננטי דיסטלי OCT4 משפר. יתר על כן, לעומת אחרים תמים שיטות לדוגמות שתוצאתם aberrantly hypomethylated טבוע לוקוסים גנומית, להחזירה-LIF-3עכשיו N-hPSC היו ללא אובדן שיטתית של דפוסי CpG הדומיננטיות או ההפסד הדי methyltransferase הביטוי (למשל, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
תרבות LIF-3עכשיו ישיר של מגוון רחב של קונבנציונאלי תאי גזע עובריים (hESC), אנושי המושרה גזע pluripotent (hiPSC) גדל על מזינים או E8 מזין ללא תנאים מושגת לדוגמות מהיר ולא בתפזורת מדינה כמו epiblast תמים. עם זאת, לדוגמות תמים LIF-3עכשיו ישיר עשוי להיות בלתי-יעיל כמה שורות hPSC קונבנציונלי לא יציב בגלל variabilities גנומית, שושלת היוחסין-איפה זה מונח הטבועה הנובעים הרקעים התורם מגוונת מבחינה גנטית.
לפיכך, כדי להרחיב את תוכנית השירות של השיטה LIF-3עכשיו, אופטימיזציה stepwise פותחה והיא מוצגת בזאת, מאפשר לדוגמות תמים אוניברסלי עם כמעט כל hESC קונבנציונאלי או קו hiPSC ללא transgene בתרבית על מזינים. שיטה זו לדוגמות תמים universalized מעסיקה צעד ארעי התרבות הראשונית המקובלת hPSC המשלימים את הקוקטייל LIF-3עכשיו עם שני נוספים מולקולות קטנות (LIF-5i) פלאטין קינאז (forskolin) ו- (סוניק הקיפוד, (שקט) purmorphamine) איתות. פסקה אחת הראשונית hPSC המקובלת ב- LIF-5i עצמו אותם עוקבות לדוגמות LIF-3עכשיו יציב בכמויות. הסתגלות LIF-5i הראשונית מגבירה באופן משמעותי התפשטות המשובטים תא בודד הראשונית של hPSC המקובלת גדל על E8 או כדורים אקדחים סטרט (לפני שלהם עוקבות יציב, מתמשך מעבר LIF-3עכשיו לבד). קווים hPSC המקובלת הותאם קודם על פסקה אחת ב- LIF-5i לסבול בצובר עוקבות המשובטים passaging של תאים להחזירה תמים בתנאים LIF-3עכשיו, אשר obviates את הצורך לאסוף, subcloning של המושבות יציב נדיר או השימוש השגרתי מולקולות אנטי-מוות או מעכבי קינאז (רוק) Rho-הקשורים חלבון.
השיטה LIF-3עכשיו כבר מועסקים בהצלחה להרחיב ולתחזק רפרטואר רחב של stably > 30 קווי hPSC המקובלת עצמאי, מגוונת מבחינה גנטית > פסוקים 10 – 30, בשיטות או דיסוציאציה-אנזימטי או אנזימטיות, ללא עדות אינדוקציה של כרומוזומלית או חריגות epigenomic, לרבות ליקויים ב לוקוסים גן הדומיננטיות. בנוסף, תרבות LIF-5i/LIF-3עכשיו סדרתית היא תמימה היחידה לדוגמות השיטה שדווחו עד כה המשפרת את pluripotency תפקודית של רפרטואר רחב של קווי hPSC המקובלת על ידי הפחתת ביטוי הגנים בשלה שושלת היוחסין שלהם, שיפור דרמטי מחוזקה בידול multipotent. LIF-3עכשיו תמים לדוגמות שיטת ומוחק הגלום לבטן השתנות של בידול של קווי hPSC היוחסין-איפה זה מונח, קונבנציונאלי, ויהיה כלי נהדר של היישום ברפואה רגנרטיבית וטיפולים הסלולר.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת LIF-3עכשיו חל גרסה מותאמת של קלאסי 2i מאתר תמים לדוגמות קוקטייל1 גזע pluripotent אנושי. העצמי-חידוש hPSC (אשר לא יכול להרחיב ב- 2i לבד) הוא התייצב LIF-2i להשלים זה קוקטייל עם החומר המדכא tankyrase XAV939. תרבות LIF-3עכשיו מאפשר בצובר לדוגמות יעיל של hPSC המקובלת מדינה pluripotent הדומה את האדם epib…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), פרס החדשנות שטיין RPB, מרילנד תאי גזע מחקר הקרן (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), נובו נורדיסק המדע פורום פרס, קרן מוזלי.
Materials
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |
Referenzen
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
- Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
- Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203 (2014).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838 (2012).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
- Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
- Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
- Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
- Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
- Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
- Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
- Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
- Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
- Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
- Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
