Le système de culture 2i (inhibiteur de la MEK/ERK et GSK3β) a été développé pour améliorer les cultures des cellules souches embryonnaires (mESC) hétérogènes axée sur le sérum de souris à un état fondamental uniform de pluripotence s’apparente à l’épiblaste préimplantatoire souris¹. Cependant, 2i ne supporte pas le maintien stable de pluripotentes humaines les cellules souches (hPSC) lignes². Les différents complexes petites molécules, additionné de facteur de croissance et les approches transgéniques ont récemment été rapportés pour capturer putativement similaires naïve comme pluripotentes moléculaire indique². Toutefois, nombre d’Etats « naïve-like » a aussi créés avec ces méthodes exposées caryotypique instabilité, épigénomique défauts (par exemple, la perte globale de l’empreinte génomique parentale) ou affaiblies potentiel de différenciation.

En contraste, le cocktail de triple inhibition chimique de GSK3β, ERK et signalisation de la tankyrase et facteur inhibiteur de leucémie (LIF-3i) était suffisant pour que la réversion naïve comme stable d’un vaste répertoire de classiques hPSC lignes³. FRV-3i-revenue naïve hPSC (N-hPSC) maintenu caryotypes normaux et ont augmenté leurs expressions de gènes de l’épiblaste préimplantatoire humaine naïve spécifiques (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). FRV-3i reversion conférée aussi hPSC avec un éventail de caractéristiques moléculaires et biochimiques particulières à la pluripotence mESC comme naïve qui inclus STAT3 phosphorylée de signalisation accrue, diminution de la phosphorylation de ERK, global 5-méthylcytosine CpG l’hypométhylation, déméthylation CpG génome dans les cellules souches embryonnaires (CSE)-promoteurs de gènes spécifiques et l’utilisation dominante de renforceur du OCT4 distale. Par ailleurs, en comparaison avec d’autre naïve des méthodes de réversion qui ont abouti à aberrantly hypométhylés imprimé locus génomiques, N-hPSC LIF-3i-revenue étaient dépourvues de perte systématique d’imprimés motifs CpG ou d’expression de l’ADN méthyltransférase (par exemple, DNMT3B DNMT1, DNMT3A,)³.

Une culture de FRV-3i directe d’un large éventail de classiques cellules de souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC) cultivées sur des mangeoires ou des conditions E8 chargeur atteint retour rapide et en vrac à un État épiblaste naïf. Toutefois, direct FRV-3i naïf reversion peut être inefficace dans certaines lignées hPSC classiques instable en raison les variabilités de génomiques et de la lignée-amorcé inhérentes découlant issus des milieux donneur génétiquement diversifiés.

Ainsi, pour accroître l’utilité de la méthode FRV-3i, une optimisation progressive a été développée et est présentée ici, qui permet de réversion naïf universel avec presque n’importe quel CSEh classique ou libres transgène hiPSC ligne cultivées sur les mangeoires. Cette méthode de réversion naïf universalisé emploie une étape transitoire culture initiale en hPSC classique qui complètent le cocktail FRV-3i avec deux autres petites molécules (FRV-5i) qui potentialisent la protéine kinase A (la forskoline) et sonic hedgehog (sHH) ( signalisation de Purmorphamine). Un passage initial de hPSC classique en FRV-5i adapte à ultérieure stable FRV-3i réversion en grandes quantités. Adaptation de FRV-5i initiale augmente significativement la prolifération clonale initiale seule cellule des hPSC classique cultivée sur E8 ou mangeoires (avant leur adoption subséquente de stable et continue en FRV-3i seul). Lignes hPSC conventionnel adaptés tout d’abord à un passage en FRV-5i tolèrent subséquentes en vrac clonale passage des naïfs-revenue des cellules dans des conditions de FRV-3i, qui élimine la nécessité pour la récolte et subcloning de rares colonies stables, ou l’utilisation systématique de molécules anti-apoptotiques ou inhibiteurs de protéine associée à Rho kinase (ROCK).

La méthode FRV-3i a été avec succès employée stablement développer et maintenir un vaste répertoire de > 30 lignes hPSC classiques indépendants et génétiquement diversifiée pour > 10 – 30 passages à l’aide de deux méthodes de dissociation non enzymatique ou enzymatique, et sans preuve d’induction de chromosomiques ou d’anomalies épigénomique, y compris les anomalies à l’imprimé locus. En outre, séquentiel FRV-5i/FRV-3i culture est la méthode la réversion seule naïve qui a jusqu’à présent été signalée qui améliore la pluripotence fonctionnelle d’un vaste répertoire des lignes conventionnelles hPSC en diminuant leur expression de gène lineage-amorcé et considérablement améliorer leur potentiel de différenciation multipotentes. Le FRV-3i naïf reversion méthode efface l’inhérente interligne de variabilité de la différenciation des lignes conventionnelles, apprêtée à la lignée hPSC et aura une grande utilité de l’application en médecine régénératrice et de thérapies cellulaires.