Chemische terugkeer van conventionele menselijke pluripotente stamcellen naar een naïef-achtige toestand met verbeterde Multilineage differentiatie potentie
Summary
Presenteren we een protocol voor snelle, efficiënte en bulk chemische terugkeer van conventionele lineage-primer menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) in een epigenomically-stable naïef voor inplanting epiblast-achtige pluripotente staat. Deze methode resulteert in verminderde lineage-primer genexpressie en duidelijke verbetering gestuurde multilineage differentiatie over een breed repertoire van conventionele hPSC lijnen.
Abstract
Naïef menselijke pluripotente stamcellen (N-hPSC) met verbeterde functionaliteit wellicht een brede uitstraling in de regeneratieve geneeskunde. Het doel van dit protocol is efficiënt lineage-primer, conventionele menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) bijgehouden op feeder-vrije of feeder-afhankelijke voorwaarden aan een naïef-achtige pluripotent met verbeterde functionaliteit te herstellen. Deze chemische naïef terugkeer methode maakt gebruik van de klassieke leukemie remmende factor (LIF), GSK3β, en MEK/ERK inhibitie cocktail (LIF-2i), aangevuld met alleen een tankyrase-remmer XAV939 (LIF-3i). LIF-3i hersteld conventionele hPSC een stabiele pluripotente staat aanneming van biochemische, transcriptionele en epigenetische kenmerken van de menselijke pre-implantatie-epiblast. Deze methode LIF-3i vereist minimale cel cultuur manipulatie en is zeer reproduceerbaar in een breed repertoire van menselijke embryonale stamcellen (hESC) en menselijke transgenic-vrije geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) lijnen. De LIF-3i-methode vereist geen een opnieuw aanzuigende stap vóór de differentiatie; N-hPSC rechtstreeks met extreem hoge efficiëntie kan worden gedifferentieerd en onderhouden van karyotypic en epigenomic stabilities (ook op ingeprinte loci). Het vergroten van de universaliteit van de methode, worden de conventionele hPSC eerst gekweekt in de cocktail van de LIF-3i aangevuld met twee extra kleine moleculen die versterken proteïne kinase een (forskolin) en sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) (LIF-5i) signalering. Deze korte LIF-5i aanpassing stap aanzienlijk verbetert de eerste klonale uitbreiding van conventionele hPSC en vergunningen kunnen worden vervolgens naïef-teruggekeerd met LIF-3i alleen in grote hoeveelheden, dus het wegnemen van de noodzaak van picking/subcloning zeldzame N-hPSC kolonies later. LIF-5i-gestabiliseerde hPSCs worden vervolgens bijgehouden in LIF-3i alleen zonder de noodzaak van anti-apoptotic moleculen. Bovenal verbetert LIF-3i terugkeer aanzienlijk de functionele pluripotent van een breed repertoire van conventionele hPSC door dalende hun lineage-primer genexpressie en wissen van de interline variabiliteit van gestuurde differentiatie algemeen waargenomen onder onafhankelijke hPSC lijnen. Representatieve karakterisaties voor N-hPSC LIF-3i-teruggekeerd zijn verstrekt, en experimentele strategieën voor functionele vergelijkingen van isogene hPSC in bloedlijn-primer vs. naïef-achtige Staten worden beschreven.
Introduction
Het 2i (MEK/ERK en GSK3β-remmer) cultuur systeem werd oorspronkelijk ontwikkeld om heterogene serum gebaseerde muis embryonale stamcellen (mESC) culturen tot een uniforme grondtoestand van pluripotent verwant aan de muis voor inplanting epiblast1te verfijnen. 2i biedt echter geen ondersteuning voor de stabiele onderhoud van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) lijnen2. De verschillende complexe klein molecuul, groeifactor-aangevuld, en transgene benaderingen hebben onlangs gemeld om vast te leggen van vermeende soortgelijke menselijke naïef-achtige pluripotente moleculaire stelt2. Echter veel van de “naïeve-achtige” toestanden aangemaakt met deze methoden ook tentoongesteld karyotypic instabiliteit, epigenomic gebreken (bijvoorbeeld globale verlies van ouderlijke genomic imprinting), of verminderde potentiële differentiatie.
In contrast, de cocktail van triple chemische remming van GSK3β, ERK en tankyrase signalering en leukemie remmende factor (LIF-3i) was voldoende om de stabiele naïef-achtige terugkeer van een breed repertoire van conventionele hPSC lijnen3. LIF-3i-teruggekeerd naïef hPSC (N-hPSC) onderhouden van normale karyotypes en verhoogde hun uitdrukkingen van naïef-specifieke menselijke voor inplanting epiblast genen (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i terugkeer ook verleende hPSC met een array van moleculaire en biochemische kenmerken die uniek zijn voor mESC-achtige naïef pluripotent die verhoogde gefosforyleerd STAT3 signalering opgenomen, daalde ERK fosforylatie, global 5-methylcytosine-apr hypomethylation, genoom-brede apr demethylatie op embryonale stamcellen (ESC)-specifiek gen initiatiefnemers en dominante distale OCT4 versterker gebruik. Bovendien, in vergelijking met andere naïef terugkeer methoden die in aberrantly hypomethylated resulteerde bedrukt genomic loci, N-hPSC LIF-3i-teruggekeerd waren verstoken van systematische verlies van ingeprinte CpG patronen of DNA methyltransferase expressie (b.v., DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
Een directe LIF-3i cultuur van een breed scala aan conventionele menselijke embryonale cellen (hESC) en menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) gegroeid op feeders of E8 feeder-vrij voorwaarden bereikt snelle en bulk terugkeer naar een naïef epiblast-achtige toestand. Directe LIF-3i naïef terugkeer kan evenwel in sommige unstable conventionele hPSC lijnen als gevolg van de inherente genomic en lineage-primer variabiliteiten die voortvloeien uit de genetisch divers donor achtergronden inefficiënt.
Dus, het verbreden van het nut van de LIF-3i-methode, een stapsgewijze optimalisatie werd ontwikkeld en hierin wordt gepresenteerd waarmee universele naïef terugkeer met bijna elke conventionele hESC of transgenic-vrije hiPSC lijn gekweekte op feeders. Deze universalized naïef terugkeer methode maakt gebruik van een voorbijgaande eerste cultuur stap in conventionele hPSC dient als aanvulling op de LIF-3i cocktail met twee extra kleine moleculen (LIF-5i) die versterken proteïne kinase een (forskolin) en sonic hedgehog (sHH) ( purmorphamine) signalering. Één van de eerste passage van conventionele hPSC in LIF-5i past hen tot latere stabiele LIF-3i terugkeer in grote hoeveelheden. Eerste LIF-5i aanpassing verhoogt aanzienlijk de eerste eencellige klonale verspreiding van conventionele hPSC geteeld op E8 of feeders (vóór hun latere stabiele, continue passage in LIF-3i alleen). Conventionele hPSC lijnen aangepast eerst tolereren op één passage in LIF-5i latere bulk klonale passaging van cellen naïef-teruggekeerd in LIF-3i voorwaarden, die ondervangt de behoefte aan plukken en subcloning van de zeldzame stabiele kolonies, of het routinematig gebruik van anti-apoptotic moleculen of Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK) remmers.
De methode LIF-3i heeft gewerkt voor stabiel uitbreiden en onderhouden van een breed repertoire van > 30 onafhankelijke, genetisch divers conventionele hPSC lijnen voor > 10 – 30 passages met behulp van beide methoden niet-enzymatische of enzymatische dissociatie, en zonder bewijs van inductie van chromosomale of epigenomic voorkomende afwijkingen, waaronder afwijkingen op ingeprinte gene loci. Bovendien, sequentiële LIF-5i/LIF-3i cultuur is de enige naïef terugkeer methode die tot nu toe heeft gemeld dat de functionele pluripotent van een breed repertoire van conventionele hPSC lijnen verbetert door het verlagen van hun afkomst-primer genexpressie en drastisch verbeteren van hun potentie multipotente differentiatie. De LIF-3i naïef terugkeer methode wist de inherente zal variabiliteit van differentiatie van lineage-primer, conventionele hPSC lijnen interline, en een groot nut van toepassing in de regeneratieve geneeskunde en cellulaire therapieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
De LIF-3i-systeem geldt een gewijzigde versie van de klassieke lymfkliertest 2i naïef terugkeer cocktail1 voor menselijke pluripotente stamcellen. De zelf-vernieuwing van hPSC (die kan niet uitbreiden in 2i alleen) is gestabiliseerd in LIF-2i beogen deze cocktail met XAV939 van de tankyrase-remmer. LIF-3i cultuur kunt bulk en efficiënte terugkeer van de conventionele hPSC naar een toestand van de pluripotente die lijkt op de menselijke voor inplanting epiblast<sup class=…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland stamcel onderzoeksfonds (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award en de Moseley Foundation.
Materials
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |
Referenzen
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
- Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
- Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203 (2014).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838 (2012).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
- Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
- Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
- Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
- Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
- Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
- Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
- Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
- Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
- Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
- Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
