従来のひと多能性幹細胞の向上多能分化と素朴なような状態の復帰化学
Summary
効率的な一括、および急速な化学復帰従来系列プライミングひと多能性幹細胞 (hPSC) の epigenomically 安定した素朴な着床前胚盤葉上層のような多能性状態にするためのプロトコルを提案します。このメソッド結果減少系統プライミング遺伝子発現と分化多能でマーク付きの改善で従来の hPSC ラインの幅広いレパートリー。
Abstract
素朴なひと多能性幹細胞 (N hPSC) 機能改善された再生医療全体への影響があります。このプロトコルの目的は、効率的にリネージュ プライミング、従来人間多能性幹細胞 (hPSC) を機能改善された世間知らずのような多能性フィーダー無料またはフィーダーに依存した条件で保持される元に戻すです。復帰するこの化学世間知らずの手法では古典的な白血病抑制因子 (LIF)、GSK3β、MEK/ERK 抑制がカクテル (LIF 2 i) の時にタンキラーゼ阻害剤 XAV939 のみと補われる (LIF 3 i)。LIF 3i 生化学的解析、転写を採用し安定した多能性状態と人間着床前胚盤葉上層のエピジェネティックな機能を従来の hPSC を元に戻します。この LIF 3i メソッドは、ヒト胚性幹細胞 (hESC) と transgene 無料ひと誘導多能性幹細胞 (による) 線の広いレパートリーの中で再現性の高い最小限細胞培養操作が必要です。LIF 3i 方法では分化; 前に再プライミングの手順は必要ありません。N hPSC は非常に高い効率を直接区別できる保守核型とエピゲノム安定性 (捺印された遺伝子を含む)。、法の普遍性を向上させるため、従来の hPSC は蛋白質キナーゼ (フォルスコリン) とソニック ・ ザ ・ ヘッジホッグ (sHH) (purmorphamine) (LIF-5i) のシグナルを増強する 2 つの追加小分子添加 LIF 3i カクテルで培養最初。この簡単な LIF 5i 適応ステップ大幅に従来の hPSC の初期のクローン性増殖を強化し、LIF-3i バルク量で一人でこうしてピッキング/subcloning 珍しい N-hPSC のための必要があるとその後素朴な復帰することができるようにその後の植民地。LIF 5i 安定 hPSCs その後に保持されます LIF 3i 抗アポトーシス分子を必要とせず単独で。最も重要なは、LIF 3i 復帰は著しくリネージュ プライミング遺伝子発現を減少させると分化のインター ライン変動をよく消去によって向上従来 hPSC の幅広いレパートリーの機能的な多能性独立した hPSC ラインの中で観察。LIF 3i 戻った N hPSC の代表的な特徴は、リネージュ プライミング対同質遺伝子 hPSC の機能比較のため、そして実験的戦略です。素朴なような状態のとおりです。
Introduction
2i (MEK/ERK と GSK3β 阻害剤) 文化システムはマウス着床前胚盤葉上層1と同類の多能性の基底状態の制服に異種血清を用いたマウス胚性幹細胞 (mESC) 文化を絞り込むに元々 開発されました。ただし、2 i は、ひと多能性幹細胞 (hPSC) 線2の維持安定をサポートしません。様々 な成長因子の添加、複合体の小さい分子や形質推定をキャプチャする報告されている最近似たような人間のような素朴な多能性分子状態2。ただしもこれらのメソッドで作成された「世間知らずのような」状態の多くは核型不安定性、エピゲノム欠陥 (親ゲノムインプリンティングの例えば、グローバル損失) を展示や分化の障害。
コントラスト、トリプルの化学的阻害剤 GSK3β、ERK およびタンキラーゼ シグナリングのカクテルと白血病抑制因子 (LIF 3 i) は従来の hPSC ライン3の幅広いレパートリーの安定した世間知らずのような復帰のため十分でした。LIF 3i 戻す素朴な hPSC (N hPSC) 正常核型を維持し、素朴な固有人間着床前胚盤葉上層の遺伝子の表現を増加した (e.g.,NANOG、 KLF2 NR5A2、DNMT3L、HERVH、ステラ (DPPA3)、 KLF17、 TFCP2L1)。MESC のような素朴な多能性リン酸化 STAT3 シグナリング増加含まれて、ERK のリン酸化、グローバル 5-メチルシトシン CpG を減少するユニークな分子および生化学的な特性の配列と LIF 3i 復帰も授与 hPSC低いメチル化、胚性幹細胞 (ESC) のゲノム広い CpG メチル-特定の遺伝子の促進者と支配的な遠位 OCT4 エンハンサー使用。また、他の世間知らずと比較して異常 hypomethylated の結果返還方法刻印ゲノム遺伝子座, LIF 3i 戻った N hPSC 刻印 CpG パターンの体系や DNA メチルトランスフェラーゼ式の損失を欠いている (などDNMT3A、DNMT1 DNMT3B)3。
従来ヒト胚性幹細胞 (hESC)、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) の送り装置か E8 フィーダー無料条件で栽培の広範な配列の直接 LIF 3i 文化は、素朴な鱗のような状態に迅速かつ一括返還を実現しました。ただし、直接 LIF 3 i 素朴な返還が遺伝的多様なドナーの背景から生じる固有のゲノムとリネージュ プライミングの変動のためのいくつかの不安定な従来の hPSC ラインで効率的にあります。
したがって、LIF 3i 手法の有用性を広げるため開発された段階的最適化と記載はほぼ従来 hESC や無料の遺伝子によるラインと普遍的な素朴な復帰をフィーダーに培養可能します。このじっさい素朴な復帰メソッドが 2 つ追加小さな分子 (LIF-5i) プロテインキナーゼ (フォルスコリン) とソニック ・ ザ ・ ヘッジホッグ (sHH) (増強と LIF 3i カクテルを補足する従来の hPSC の一時的な初期文化ステップを採用していますpurmorphamine) 信号。LIF-5i で従来の hPSC の 1 つの初期の通路はバルク量でその後の安定した LIF 3i 復帰にそれらを適応させます。初期の LIF 5i 適応は、E8 または送り装置 (LIF-3 i だけでその後安定的、連続的な通路) の前に上に成長した従来の hPSC の初期の単一細胞のクローン増殖を大幅強化します。適応従来の hPSC ライン最初 LIF 5i で 1 つの通路に耐える以降一括クローン継 LIF 3i 条件で素朴な戻す細胞のまれな安定したコロニーのルーチンの使用の subcloning を選択しする必要がなくなります、抗アポトーシス分子または Rho 関連タンパク質キナーゼ (ロック) 阻害剤。
LIF 3i メソッドを正常に安定して拡大し、幅広いレパートリーを維持に雇われている > の 30 の独立した、遺伝的に多様な従来の hPSC ライン > 非酵素または酵素の解離のいずれを使用して 10-30 通路と染色体の誘導の証拠なしやエピゲノム異常、インプリント遺伝子の遺伝子異常を含みます。さらに、シーケンシャルの LIF 5i/LIF 3i 文化はリネージュ プライミング遺伝子発現を減少させることによって従来の hPSC ラインの幅広いレパートリーの機能的な多能性を向上させるだけの素朴な復帰方法これまで報告されているとその多能性分化能が大幅に向上。素朴な復帰メソッドの LIF 3i 消去固有インター ラインの血統で、プライミング、従来の hPSC ラインの分化の変動と再生医療と細胞療法のアプリケーションの偉大なユーティリティ。
Protocol
Representative Results
Discussion
LIF 3 i システムは、ひと多能性幹細胞に古典的なマウス 2i 素朴な復帰カクテル1の修正版を適用されます。(これは 2 i だけで展開できない) hPSC の自己更新タンキラーゼ阻害剤 XAV939 とこのカクテルを補うことで LIF 2i で安定させます。LIF 3i 文化では、バルクと人間着床前胚盤葉上層3のような多能性の状態に従来の hPSC の効率的な帰?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH/ネイ (R01EY023962)、NIH/NICHD (R01HD082098)、RPB スタイン ・ イノベーション ・ アワードのメリーランド州の幹細胞研究基金 (2014-MSCRFE-0742 2018-MSCRFV-4048)、ノボ ノルディスク科学フォーラム賞、モーズリー財団からの助成金によって支えられました。
Materials
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |
Referenzen
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