الارتداد الكيميائية للخلايا الجذعية Pluripotent البشرية التقليدية إلى حالة شبيهة بالسذاجة مع التمايز مولتيلينيجي تحسين فاعلية
Summary
نقدم بروتوكول للكفاءة والسائبة والسريع الارتداد الكيميائية الخلايا الجذعية pluripotent البشرية التقليدية أعدادا النسب (هبسك) إلى دولة برييمبلانتيشن مثل epiblast pluripotent السذاجة ابيجينوميكالي مستقرة. نتائج هذا الأسلوب في التعبير الجيني انخفاض النسب أعدادا وتحسن ملحوظ في تمايز مولتيلينيجي الموجهة عبر مرجع واسع النطاق من خطوط هبسك التقليدية.
Abstract
السذاجة البشرية pluripotent الخلايا الجذعية (N-هبسك) مع تحسين الأداء الوظيفي قد أثر على نطاق واسع في الطب التجديدي. والهدف من هذا البروتوكول أن تعود كفاءة الخلايا الجذعية pluripotent البشرية أعدادا النسب، التقليدية (هبسك) المحافظة على ظروف خالية من علبة التغذية بالورق أو علبة التغذية بالورق-تعتمد على أن السذاجة مثل بلوريبوتينسي مع تحسين الأداء الوظيفي. يستخدم هذا الأسلوب الارتداد السذاجة الكيميائية اللوكيميا الكلاسيكية المثبطة عامل (LIF)، GSK3β، ومنظمة مجاهدي خلق/إيرك تثبيط كوكتيل (ليف-2i)، وتستكمل مع فقط مثبط تانكيراسي XAV939 (ليف-3i). ليف-3i يعود هبسك التقليدية إلى دولة مستقرة pluripotent اعتماد النسخي، والكيمياء الحيوية، وميزات جينية من epiblast غرس ما قبل البشرية. يتطلب الحد الأدنى خلية ثقافة التلاعب هذا الأسلوب ليف-3i وهو الغاية استنساخه في مرجع واسع النطاق من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسك) وخطوط خالية من التحوير البشرية المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (هيبسك). لا يتطلب الأسلوب ليف-3i خطوة إعادة فتيلة قبل التمايز؛ ن-هبسك يمكن أن تكون متباينة مباشرة مع كفاءات عالية للغاية والحفاظ على كاريوتيبيك وزيادة ابيجينوميك (بما في ذلك في مواضع مطبوع). ولزيادة الطابع العالمي للأسلوب، تستزرع هبسك التقليدية أولاً في كوكتيل ليف-3i تكملة مع اثنين من جزيئات صغيرة إضافية أن تحفيز البروتين كيناز (فورسكولين) وسونيك القنفذ (sHH) (بورمورفاميني) مما يشير إلى (ليف-5i). هذه الخطوة التكيف 5i ليف قصيرة إلى حد كبير يعزز توسيع الاستنساخ الأولية هبسك التقليدية ويسمح لها أن تكون بعد ذلك عادت ساذجة مع ليف-3i وحدها بكميات كبيرة، مما ينفي الحاجة إلى الانتقاء/سوبكلونينغ نادرة N-هبسك المستعمرات في وقت لاحق. يتم الاحتفاظ هبسكس ليف-5i-استقرت فيما بعد في ليف-3i وحدها دون الحاجة للجزيئات المضادة أبوبتوتيك. الأهم من ذلك، العودة ليف-3i يحسن ملحوظا بلوريبوتينسي الوظيفية مرجع واسع النطاق هبسك التقليدية بالتناقص على التعبير الجيني أعدادا النسب ومحو تقلب الناقلات من التمايز الموجهة عادة ولاحظ بين خطوط هبسك المستقلة. هي الأوصاف تمثيلاً لليف-3i-عادت N-هبسك الاستراتيجيات المقدمة، والتجريبية للمقارنات الفنية من هبسك اسوي في النسب معبي مقابل. وترد الدول الشبيهة بالسذاجة.
Introduction
نظام الثقافة 2 طاء (مثبط لمنظمة مجاهدي خلق/إيرك و GSK3β) وضعت أصلاً صقل الماوس غير متجانسة على أساس المصل الخلايا الجذعية الجنينية (مسك) الثقافات إلى دولة أرض موحدة من بلوريبوتينسي أقرب إلى preimplantation epiblast الماوس1. ومع ذلك، لا يدعم 2 طاء مستقرة صيانة خطوط الخلايا الجذعية (هبسك) pluripotent البشرية2. جزيء صغير معقدة، عامل النمو-تستكمل، ومحوره وراثيا النهج المختلفة ذكرت في الآونة الأخيرة لالتقاط مزعومة مماثلة pluripotent الشبيهة بالسذاجة البشرية الجزيئية الدول2. ومع ذلك، العديد من الدول “ساذجة مثل” التي تم إنشاؤها بواسطة هذه الأساليب أيضا أظهرت عدم الاستقرار كاريوتيبيك، ابيجينوميك العيوب (مثلاً، الخسارة العالمية للطباعة الجينوم الأبوية)، أو ضعف التمايز المحتملة.
في التباين، مزيج تثبيط الكيميائية ثلاثية GSK3β، إيرك وإشارات تانكيراسي والعوامل المثبطة اللوكيميا (ليف-3i) كان كافياً لعودة الشبيهة بالسذاجة مستقرة مرجع واسعة ل خطوط هبسك التقليدية3. هبسك ليف-3i-عادت السذاجة (N-هبسك) المحافظة على كاريوتيبيس العادي وزيادة تعبيرهم عن الجينات البشرية epiblast preimplantation الخاصة بالسذاجة (e.g.,NANOG، KLF2، NR5A2، DNMT3L، هيرفه، ستيلا (DPPA3)، KLF17 ، TFCP2L1). ليف-3i الارتداد أيضا تمنح هبسك مع مجموعة خصائص الجزيئية والبيوكيماويه فريدة من نوعها بلوريبوتينسي ساذجة مثل مسك شملت زيادة إشارات STAT3 فوسفوريلاتيد، وانخفض إيرك الفسفرة، البد العالمية 5-ميثيلسيتوسيني هيبوميثيليشن، ديميثيليشن البد على نطاق الجينوم في الخلايا الجذعية الجنينية (ESC)-المروجين جين معين، ومهيمنة استخدام محسن OCT4 القاصي. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع غيرها من السذاجة مطبوع أساليب العودة التي أدت إلى أبيرانتلي هيبوميثيلاتيد المكاني الجينوم، هبسك ن ليف-3i-عادت كانت تخلو من فقدان مطبوع البد أنماط منتظمة أو فقدان التعبير methyltransferase الحمض النووي (مثلاً، DNMT3B DNMT1، DNMT3A،)3.
ثقافة 3i ليف مباشرة من مجموعة واسعة من التقليدية البشرية الخلايا الجذعية الجنينية (هيس)، والخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسك) نمت على مغذيات أو ظروف خالية من تغذية E8 تحقيق العودة السريعة والسائبة لدولة مثل epiblast ساذجة. بيد 3i ليف مباشرة ساذجة العودة قد تكون غير فعالة في بعض خطوط هبسك التقليدية غير مستقرة بسبب التقلبات الجينوم وتستعد النسب المتأصلة الناجمة عن الخلفيات المتنوعة وراثيا المانحين.
وهكذا، لتوسيع الأداة المساعدة لأسلوب ليف-3i، تحسين تدريجي ووضعت وهو المقدمة في هذه الوثيقة، التي يسمح العودة السذاجة العالمي مع ما يقرب من أي هيس التقليدية أو خط هيبسك خالية من التحوير مثقف على مغذيات. يستخدم هذا الأسلوب الارتداد السذاجة إضفاء الطابع العالمي خطوة عابرة ثقافة أولية في هبسك التقليدية التي تكمل كوكتيل ليف-3i مع اثنين إضافية الجزيئات الصغيرة (ليف-5i) أن تحفيز البروتين كيناز (فورسكولين) و (سونيك القنفذ (sHH) مما يشير إلى بورمورفاميني). مرور أولية واحدة هبسك التقليدية في ليف 5i لهم تتكيف مع الارتداد ليف-3i مستقرة اللاحقة بكميات كبيرة. الأولية 5i ليف التكيف تقوي إلى حد كبير وحيد الخلية الأولى انتشار الاستنساخ هبسك التقليدية التي نمت في E8 أو مغذيات (قبل اللاحقة مستقرة ومستمرة مرورهم في ليف-3i وحدها). خطوط هبسك التقليدية تكييفها أولاً إلى مرور واحد في ليف 5i تحمل الجملة اللاحقة الاستنساخ باساجينج من السذاجة عادت الخلايا في ظروف ليف-3i، مما يغني عن الحاجة إلى الانتقاء وسوبكلونينغ المستعمرات مستقرة نادرة، أو الاستخدام الروتيني الجزيئات المضادة أبوبتوتيك أو مثبطات البروتين المرتبطة رو كيناز (روك).
الأسلوب ليف-3i قد استخدمت بنجاح لتوسيع ستابلي والحفاظ على مرجع واسع النطاق > 30 خطوط هبسك التقليدية مستقلة ومتنوعة جينياً > الممرات 10 – 30 باستخدام أما أساليب الانفصال غير الانزيمية أو الانزيمية، و دون دليل على تحريض كروموسومية أو شذوذ ابيجينوميك، بما في ذلك التشوهات في الجينات مطبوع المكاني. بالإضافة إلى ذلك، متسلسلة ليف-5i/ليف-3i الثقافة هو السذاجة فقط عودة الأسلوب تم الإبلاغ عنها حتى الآن أن يحسن بلوريبوتينسي الوظيفية مرجع واسعة لخطوط هبسك التقليدية بالتناقص على التعبير الجيني أعدادا النسب و شكل كبير تحسين قوتها التمايز مولتيبوتينت. ليف-3i السذاجة العودة أسلوب يمحو الأصيل داخلية تقلب للتفريق بين خطوط هبسك معبي النسب، والتقليدية، وسيكون لها فائدة كبيرة للتطبيق في الطب التجديدي، والعلاجات الخلوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يطبق النظام ليف-3i نسخة معدلة من السذاجة 2 طاء موريني الكلاسيكية كوكتيل الارتداد1 للخلايا الجذعية pluripotent البشرية. المتمتعة بالحكم الذاتي-تجديد هبسك (التي لا يمكن أن يتوسع في 2 طاء وحدها) استقرت في ليف-2 طاء بتكميل هذا الكوكتيل مع مثبط تانكيراسي XAV939. يسمح ليف-3i الثقافة الس…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة/نيي (R01EY023962)، والمعاهد الوطنية للصحة/NICHD (R01HD082098)، جائزة الابتكار ستاين تجمع الشعب البوروندي، ميريلاند صندوق أبحاث الخلايا الجذعية (2018-مسكرفف-4048، 2014-مسكرفي-0742)، نوفو نورديسك العلم المنتدى جائزة، ومؤسسة موزلي لهذا العمل.
Materials
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |
Referenzen
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
- Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
- Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203 (2014).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838 (2012).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
- Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
- Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
- Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
- Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
- Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
- Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
- Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
- Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
- Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
- Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
