Caractérisation des Thymus-dépendants et indépendants de Thymus immunoglobuline Isotype réponses chez la souris à l’aide d’Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Les lymphocytes B sont le principal acteur dans l’immunité humorale et le seul type de cellules chez les mammifères qui sont capables de produire des anticorps, appelés également immunoglobulines (Ig)^1,2. Les anticorps sécrétés par les lymphocytes B fournissent une formidable défense contre l’invasion des agents pathogènes par l’intermédiaire de divers mécanismes, y compris la neutralisation, opsonisation et activation du complément, conduisant à l’immunité protectrice³. Sécrétion d’anticorps par les lymphocytes B n’est possible qu’après la pleine activation des cellules B spécifiques, qui nécessite, en principe que deux distincts des signaux³. Signal 1 est relayé par une liaison directe de l’antigène (Ag) pour le récepteur des cellules B (BCR) exprimé à la surface de cellules naïves spécifiques B³. Selon la source de Signal 2, activation des lymphocytes B se divisent en dépendant du thymus (TD) ou de thymus-indépendants (TI)^3,4. Une réaction antigène de TD, 2 Signal est fourni par apparenté CD4 helper (T_H) les lymphocytes T activés, qui expriment CD154, le ligand pour le récepteur de costimulation CD40 exprimé sur les cellules de B^1,2,3. Une réaction antigène de TI, Signal 2 vient de l’engagement des récepteurs Toll-like (TLR dans le cas type 1 TI Ag) ou réticulation étendue des RCO (dans le cas type 2 TI Ag) sur le B cellules^3,4. Antigènes de TI (TI-1) de type 1 sont des ligands microbiennes du TLR, y compris bactériens lipopolysaccharides (LPS), l’ARN viral et microbienne ADN CpG^4,5. Antigènes de TI (TI-2) de type 2 ont une structure très répétitive et sont en mesure de livrer prolongée et persistante de signalisation à la cellule de B par réticulation multiples de la RCO^4,6. TI-2 antigènes sont les polysaccharides antipneumococciques et polysaccharidiques conjugués haptène^6,7. Les TD et TI antigènes peuvent obtenir des réponses de IgM spécifiques de l’antigène robustes et peuvent également induire la production d’isotype commutation anticorps (IgG, IgA et IgE) avec l’aide apportée par l’antigène présentant des cellules (CPA) telles que les cellules dendritiques (CD)^{1 ,2,3}. En outre, antigènes TD et de TI sont capables d’induire des réponses de la mémoire à l’aide de TTB, mais TD antigènes sont plus efficaces pour induire la mémoire cellulaire B génération^3,8.

Dans le présent protocole, les réponses TD et TI Ig sont provoquées chez les souris par voie intrapéritonéale (i.p.) immunisation avec hémocyanine de patelle de 2,4,6-phényl-serrure d’antigènes conjugués haptène modèle (TNP-KLH) et PNT-polysaccharide (neutre, très ramifié et de masse élevée), respectivement^9,10,11. Antigènes TD sont habituellement utilisés avec un adjuvant pour améliorer la production d’anticorps¹². Ici, dans notre protocole, PNT-KLH est injecté à l’alun, un adjuvant couramment utilisé dans la vaccination études¹². Autres exemples d’adjuvants qui peuvent être utilisés, complet ou incomplet de Freund (CFA ou IFA), monophosphoryl lipide A / dicorynomycolate de tréhalose (« Ribi » adjuvant) et CpG oligodeoxynucleotides, etc.^{13, 14}. après l’immunisation, les sérums de souris sont récoltées à différents moments et anticorps PNT-spécifiques dans le sérum sont quantifiés à l’aide de Ig isotype-spécifiques enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)^{9,10, 11}.

ELISA est un axée sur la plaque qui est largement utilisé comme un outil de diagnostic en médecine et aussi comme outil d’analyse en recherche biomédicale^15,16. Il est utilisé pour la détection et la quantification des analytes, y compris les anticorps, hormones, cytokines, chimiokines et divers antigènes, etc.. ELISA peut être effectuée dans différents formats, y compris direct, indirect, sandwich et concurrentiel ELISA^15,16. En général, il s’agit de l’immobilisation de l’antigène sur une surface solide, habituellement, une plaque de Microplaque 96 puits, qui est incubée avec l’anticorps primaire. Après incubation, l’anticorps non lié est éliminé. Dans un ELISA direct, l’anticorps primaire est directement conjugué à une enzyme (généralement la peroxydase de raifort ou phosphatase alcaline), qui peut fendre un substrat chromogène pour produire un changement de couleur visible détecté par un instrument de détection de signal comme une spectrophotomètre^15,16. En revanche, si un anticorps secondaire lié à l’enzyme est utilisé pour lier les anticorps primaire, alors cela est considéré comme un de^15,ELISA indirect¹⁶. ELISA direct est plus rapide tandis que le test ELISA indirect est plus sensible^15,16. Dans un “sandwich” ELISA, les plaques sont recouverts d’un anticorps de « capture » utilisé pour immobiliser l’antigène d’intérêt dans les échantillons, et puis l’antigène capturé peut être détectée par un autre anticorps « détection » dans une manière directe ou indirecte de^{15, 16}. ELISA Sandwich offre une spécificité élevée étant donné que l’antigène est détecté par deux types d’anticorps de l’antigène. Dans un ELISA concurrent, la compétition s’établit entre l’antigène d’échantillon et l’antigène de la plaque de liaison pour la liaison à l’anticorps primaire, et puis la concentration de l’antigène dans l’échantillon est quantifiée par la mesure de la réduction du signal du substrat ^{15 , 16}. ELISA concurrent peut être effectuée en utilisant le format direct ou indirect mentionné ci-dessus et est utile pour la détection des antigènes petits avec qu’un seul épitope^15,16.

Des techniques alternatives pour la mesure des anticorps incluent radio-immunoessai (RIA),¹⁷de dosage par électrochimiluminescence (ECL) dosage et surface résonance plasmon (SPR). RIA a été le premier immuno-essai développé qui mesure la présence d’un antigène (ou anticorps) avec grande spécificité et une sensibilité à l’aide de réactifs radiomarquées^18,19. Toutefois, en raison des préoccupations de toxicité radioactive, de coûts d’élimination, de conservation et de licences spéciales pour travailler avec des matériaux radioactifs, ELISA est un meilleur et plus pratique technique commun utilise^20,21. ECL est un dosage très sensible dans lequel les réactions chimiluminescentes commencent à utiliser de l’électricité pour générer des espèces très réactives de précurseurs stables sur la surface d’une électrode et peuvent être utilisées pour mesurer la quantité d’analytes (tels que les antigènes ou les anticorps)²². Cependant, ECL nécessite un instrument spécial et est donc pas aussi largement utilisé comme ELISA²³. SPR est un dosage direct qui peut être utilisé pour mesurer la fixation des ligands (e.g., anticorps) à immobilisé molécules (e.g., antigènes) sur un capteur à puce surface²⁴. SPR détecte les interactions en temps réel très particulier et ne nécessite pas l’utilisation de réactifs marqués comme ELISA. Cependant, SPR nécessite un équipement spécial et a une sensibilité plus faible que ELISA¹⁷. Compte tenu des limites des méthodes alternatives, ELISA est la technique plus pratique et le plus appropriée pour notre but dans ce protocole. Nous décrivons ici l’utilisation du sandwich ELISA pour l’analyse des niveaux d’isotype Ig totales et les procédures de test ELISA indirect pour l’analyse des isotypes Ig spécifiques de l’antigène.