Белощекая балянусы improvisus как модель морской - выращивание и экспрессии генов

1. сбор взрослых ракушки в поле, чтобы начать новый Broodstock Развертывание термопласт (поли-метилметакрилат) прозрачные панели (110 x 110 x 1,5 мм3) на ≈ 1 – 3 м глубины в спокойных водах для того, чтобы собирать ракушки взрослых из поля. Использование кадров, которые могут занять несколько панелей (рисA), 2 отверстия (диаметром 6 мм) в верхнем углах каждой группы и attachthepanelstotherackusingcableties. Таким образом thepanelswillhangverticallyin воды. При поселении ракушки произошла (определены как небольшие белые жесткий точки на панели), оставьте панелей для по крайней мере 2-3 недели, чтобы убедиться, что ракушки большой достаточно (5 мм) могут быть переданы в лабораторию без получения сушеные или повреждены. Принесите панелей в лабораторию, когда они покрыты поселились б. improvisus , достигли размера ЦС. 5 мм indiameter.Примечание: Время для взрослых развить до 5 мм в поле сильно зависит от наличия продовольствия и температуры. Как правило, это занимает около 3 недель в морской научно-исследовательской лаборатории Tjärnö (58.87 с.ш., 11.14 ° E). Чаще всего панели для новых broodstock обычно развертываются в конце июня и собраны в конце августа. Перед внедрением панелей в объекте культуры, очистите других организмов от панелей. Наиболее важно удалить другие виды белощекая. Пожалуйста, обратите внимание, что важно часто чистить панели, чтобы избавиться от загрязняющих видов во время выращивания, так как это значительно повысит шансы на выживание broodstock. Разместите панели вертикально на краю в стенд с фрезерованные пазы в подносе полиэтилена (400 x 400 x 20 мм3) (цифры 2 c и 2E). Канавки на стенде являются 15 мм друг от друга. Чтобы подготовить лотки, сделайте вход порт на базе и порт выхода на вершине на противоположной стороне каждого лотка. Подключите порт входа каждого лотка 100 L водохранилище, содержащий около 30 Л воды с входом открытой морской воды при 20 ° C разрешить через потока со скоростью около. 2 Л / мин.Примечание: До 8 лотков были подключены к одной водохранилища 100 Л. Подключите водохранилища 100 Л к контролируемой температуры морской воды (20 ° C) (например, предоставляемые обмена тепла от входящей морской воды теплового насоса).Примечание: Белощекая B. improvisus могут расти и размножаться в полной морской соленость (30 – 35 БП); Однако уменьшение солености в ЦС. 25 psu, добавив пресной воды в водохранилище 100 L увеличивает выход личинок от культуры. 2. Запуск новых поколений взрослых от искусственного Cyprids Конструкция кубов термопластичных панелей открыть в верхней лентой 5 панелей, вместе с помощью нетоксичных, водостойкие ленты. Место куб в небольшой лоток (в случае утечки) и заполнить его с морской водой (25 psu). Сохранить воду при комнатной температуре (ОК. 20 ° C). Добавьте примерно 200 cyprids в верхней части куба. Выкармливают птенцов с 100 мл Skeletonema marinoi каждый день (см. шаг 5) в то время как в Кубе.Примечание: Несовершеннолетних ракушки может иметь трудности с глотая артемии Салина (см. шаг 3) так как они большие и, следовательно, трудно глотать для недавно поселились белощекая. Измените воды 1 раз в неделю. После 2 недель, когда панели содержат достаточно установленным несовершеннолетних минимум 5 мм в диаметре, разобрать куб и переместить панели с несовершеннолетними лотки с потоком throughseawater и, впоследствии, кормить ракушки с A. Салина хитиновой. 3. Культура науплий артемии Салина как корм для взрослых ракушки Создать систему культивирования для а. Салина , используя пластиковую бутылку 1,5 Л где bottomis cut off и бутылка помещается вверх вниз в стенд и освещенной стороны. Соответствовать узким местом в силиконовой трубки с струбциной и прикрепить его к аэрации насоса (рис. 2D). Чтобы высиживают яйца, добавьте 1 Л ofseawater около 15 мл сухого отдыхая яиц артемии .Примечание: Люк яйца артемии в nauplius личинок после 24-48 ч. Задерживать отрождение A. Салина хитиновой (например, в выходные дни), чтобы уменьшить температуру немного можно отключить свет. Чтобы урожай науплий артемии , выключите аэрации и темнее верхнюю часть бутылки с алюминиевой фольгой (или аналогичных например, can)… Освещения, которые будут плавать в нижней части бутылки для науплий артемии Hatched 10 минут к свету. Кисты не вылупились будет опускаться на дно, и кисты снарядов будет плавать на поверхности. Откройте зажим на дне. Соберите промежуточные фракции как высокая плотность населения хитиновой плавательный.Примечание: Каждый день (кроме выходных), 1 Л густой подвеска науплий артемии вручную добавляется водохранилища 100 Л, подключение к лотки с взрослого ракушки. Избегайте любых кормления с пустой кисты оболочки, так как они не обеспечивают питание и главным образом привести к необходимости чистой культуры в более короткие промежутки времени. 4. сбор и воспитания белощекая личинок Очистить панелей с взрослого ракушки, слегка поливая их с пресной водой и, при необходимости, удалите любые загрязнения из Барнакл раковины и панелей, используя мягкую зубную щетку. Кроме того, чистые подносы (без ракушки) и трубы в горячей (75 ° C) пресной воды. Место сито из 90 мкм планктон net приклеены к концу отрезанные куски трубы ПВХ (16 см в диаметре, 15 см в высоту) в полиэтиленовой лоток (30 x 20 x 10 см3) с портом переполнения. Соберите B. improvisus личинок в одночасье сито (рис. 2C).Примечание: Сито был расположен чуть ниже порт выхода лотка белощекая панелей для получения непопадание воды и отфильтровать хитиновой. Личинки оставались в сито, а морская вода захлестнула небольшой лоток. Этот небольшой лоток обеспечивает сито никогда не driedout. Место ведро 30 Л в большой водяной бане, где поддерживается температура 26 ° c, с использованием Аквариумные рыбы танк нагреватели (Рисунок 2E). Гарантируется, что пузырьков воздуха через систему аэрации и агитации. Заполните ведро 20 Л отфильтрованной морской воды (0,2 мкм; 25 psu). Добавьте 1 Л ведро смеси 60/40 2 диатомовых водорослей, S. marinoi и C. gracilis (см. шаг 5). Это даст Начальная плотность диатомовых водорослей4 5 x 10 мл в ведро.Примечание: Белощекая хитиновой личинки положительно phototactic. Ведра были сделаны из непрозрачного белого пластика с крышками, которые пропускают свет. Во время зимы номер был зажжен в дневное время (8:00 – 17:00), но темные в ночное время. В течение лета внешний свет вошел в комнату в течение большей части дня. Передавать собранные хитиновой б. improvisus к кристаллизации блюдо (50 мм в высоту, 300 мл; 90 мм в диаметре). Осветить блюдо от стороны, которая будет привлекать личинки к источнику света. Соберите белощекая науплий, которые собираются на входящего света с пипетки и перенести их в другое блюдо кристаллизации. Удалите любые оставшиеся личинки артемии . Передать личинки хитиновой B. improvisus стакан с 1 Л отфильтрованной морской воды. Подсчитать количество науплий, помешивая стакан осторожно, чтобы получить даже подвеска личинок и затем принимать пять 1 мл образцов из разных мест в стакан. Перевод каждого образца на Гонав для визуального осмотра с стереомикроскопом. Подсчитать количество науплий в каждом из пяти образцов и добавить их. Подсчитано число умножьте на 200 (1000 мл/5 мл), чтобы оценить, как много тысячи личинок находятся в целый стакан. Если есть слишком много nauplius личинок в стакан, разбавляют образец до тех пор, пока плотность не более 14 000 личинок/Л (обычно в диапазоне от 11000-12000 личинок/Л). Добавьте 1 Л б improvisus хитиновой одно ведро, тем самым добавив примерно 11000-12000 личинок в ведро.Примечание: Не забудьте добавить больше науплий, так как это приведет к слишком мало продовольствия по отношению к личинки и, следовательно, увеличение смертности. После 3 дней Соберите белощекая хитиновой на сито 90 мкм. Затем очистить ведро (с пресной водой 75 ° C), заполнить его с фильтрованной морской водой, добавить новый канал диатомовые водоросли (столько же, как в начале) и наконец добавить хитиновой снова. Cyprids начинают появляться примерно через 6 дней (± 1 день). Сначала собирают cyprids с 90 мкм сито (разработан как в пункте 4.2 выше). Затем отдельные хитиновой Барнакл moulted и cyprids с 320 мкм сито на вершине 160 мкм сито. B. improvisus хитиновой будет собирать в 320 мкм сито и cyprids в сито 160 мкм.Примечание: Cyprid личинки могут храниться на 10 ° C в кристаллизации блюдо в темноте для последующего использования, до центра сертификации. 6 дней. Однако хранения может повлиять на качество и производительность белощекая личинок, поэтому эксперименты, сравнение различных методов лечения в идеале следует использовать личинок из одной партии (и аналогичные время хранения) чтобы избежать смешанные эффекты16. 5. Культура микроводорослей в качестве корма для белощекая Nauplius личинок Примечание: Водоросли были выращены в 3 различных типов культур: (i) сток культур, которые предназначены для долгосрочного обслуживания штаммов, которые использовались для прививки масштабирования; (ii) начало культур, которые являются первым шагом в рамках шкалы; и наконец (iii) производства культуры, которая является масштаб окончательного производства большого количества водорослей как белощекая кормов. Заказать видов диатомовых от культуры коллекции водоросли и простейшие (ПДИК) для использования в качестве корма для белощекая nauplius личинки. 2 вида Skeletonema marinoi (ПДИК штамм 1077/5) и Chaetoceros симплекс var. gracilis (ПДИК штамм 1085/3) дают хорошие результаты в качестве корма. Фильтр все морской воды для использования в водорослей культуры, с помощью системы фильтрации картриджа с номинальным порами размером 0,2 мкм. (фильтрованной морской воды является также использоваться для инкубационных яиц а. Салина и культивирования белощекая nauplius личинок). Автоклав фильтрованной морской воды для водорослей культур (при 105 ° C за 5 мин). Подготовка среднего для культуры микроводорослей, используя газобетона с морской водой, обогащен Guillard f/2 раствор, содержащий неорганических питательных веществ, остаточными металлами и витамины (см.17 Guillard 1975 за подробный рецепт). Кроме того приготовляют раствор силиката (Na2SiO3), но это отделить от обогащения f/2 для предотвращения твердых осадков.Примечание: Концентрации Стоковый раствор обогащения и Стоковый раствор силиката были подготовлены для использования в качестве добавления 1 мл каждого до 1 Л морской воды. Автоклав все оборудование используется в водорослей культуры при 120 ° С 20 мин автоклав винт максимум пробирки с 1 мл f/2 обогащения и 1 мл раствора силикат. Добавьте обогащения и силикатных решения theseawater когда из стекла и жидкости остыли до комнатной температуры. Рост запасов культур микроводорослей в 40 мл пробирки с колпачки. Заполните пробирки с около 30 мл обогащенного морской воды. Прививать культуру с стерильные пипетки Пастера используя около 1 мл 2 неделя старый фондовый культуры. Колпачок затем установлены, но не затягивать, чтобы позволить некоторые газообмена. Если доступно, прививка должна осуществляться в ламинарные кабинета для снижения риска заражения.Примечание: Цель фондовых культур является для поддержания водорослей культур на долгосрочной основе и служить посевным материалом для начала культур. Складе культур были повторно привиты каждые 2 недели. Подвергайте новой культуры запасов на белый свет с интенсивностью ЦС. 25 – 50 µmole m-2s-1 (с свето тени циклом 16:8 h). Перемещение старых запасов культур к низкой интенсивности света как back-up. Отменить любые 2 неделя старый фондовый культур. Для расширения масштабов производства культуры водорослей, прививок начала культур от фонда культуры и вырастить их в 500 мл Erlenmeyerflasks. Автоклав 4 Эрленмейер колбы, пипетки и хлопка пробки с 300 мл отфильтрованных (0,2 мкм) с морской водой и 4 пробирки с 0,3 мл f/2 обогащения и 4 с решения силикат. Охлаждать f/2 обогащения и силикатных до комнатной температуры и добавить решения Эрленмейер колбы. Прививать им с ЦС. 1 мл раствора 2 – неделя старый фондовый культуры.Примечание: Подготовьте 2 фляги с S. marinoi и 2 с C. симплекс. Поставьте колбы на тряску таблицы в интенсивности света 50 µmole m-2s-1. Когда начала культуры приобрели популяциями водорослей (желто коричневого цвета), они готовы для использования в качестве посевным материалом для производства культур, которые будут предоставлять белощекая личинки с пищей. Расти производства культур в 4 Л поликарбонатные бутыли с силиконовые пробки с 2 просверленные портами оснащены стеклянной трубки. Подключение 1 стеклянная трубка, достигнув в нижней части бутылки насос воздуха через силиконовые трубки установлен фильтр воздуха 0,2 мкм. Убедитесь, что второй стеклотрубки заканчивается чуть ниже пробки и наполнен хлопок разрешить выход вводят воздуха. Каждую неделю, заполнить четыре 4 Л бутылки с фильтрованной морской и автоклав их вместе с пробками. Кроме того Автоклавы 4 пробирки с 4 мл f/2 обогащения и силикатных решений. После охлаждения, добавить f/2 обогащения и силикатных решения в бутылки и прививать им с половина объема начального культур в колбах Эрленмейера. Поместите четыре 4 Л бутылки в интенсивности света, 50-100 µmole m-2s-1. Урожай производства культур после ЦС. 1 неделя; Затем они достаточно плотной, чтобы использоваться для кормления белощекая nauplius личинки.Примечание: Производство культур имеют срок службы около 2 недель, что означает, что есть 8 активных производства бутылок в любое время. 6. Разработка экспериментальных исследований с использованием ракушки Разместите панели с несовершеннолетних или взрослых ракушки в контролируемых аквариумов, где они могут быть выращены под identicalconditions. Это называется общим сад эксперимент, который, например, может использоваться для понимания местной адаптации или фенотипические пластичности18, или для изучения изменения выражения гена с учетом внешних факторов (например, солености, температуры или рН).Примечание: Это также можно использовать ракушки, непосредственно собранные из поля на панели. Преимуществом использования лабораторных разводят людей является, что матери эффектов можно избежать при использовании следующего поколения потомков. Разоблачить ракушки для конкретных условий окружающей среды во время chosentime интервал, после сбора урожая взрослых (например, для исследования по экспрессии генов)2. Для экспериментов с cyprid личинок для изучения выражения гена3место cyprids в контролируемых аквариумов, где личинки могут культивироваться в одинаковых условиях. Урожай cyprids после определенного периода времени путем фильтрации с сита (как описано в шаге 4.7) и извлечь РНК согласно протоколам ниже (шаг 8). 7. рассечение ракушки Очистить пространство лаборатории где исполняются диссекции и проб ДНК, bothbefore и между людьми, включая все инструменты рассечение. Это делается с использованием хлора для скамьи (или этанол 96% для щипцов).Примечание: Маркированные пробирки, содержащие фиксации СМИ (этанол или стабилизации решение РНК) готовятся заранее. Выбор большой и краткосрочных голодали лиц (не кормить их за 2 дня до вскрытия). Очистите белощекая оболочки с зубной щеткой, чтобы свести к минимуму риск загрязнения от других видов (например, бактерии, водоросли) и промойте его водой.Примечание: Для краткосрочного голода людей перед рассечение причина избежать любого загрязнения ДНК (например, от артемии в кишечнике ). Место отдельных ракушки на ровной поверхности, прилагаемый к панели или насыпью в блюдо. Анализировать соответствующие ткани от взрослого. Есть несколько способов, чтобы вскрывать ракушки, в зависимости от цели исследования. Метод вскрытия A: фиксации весь белощекая как можно быстрее. Удалите весь белощекая из панели с помощью скальпеля, вставив его под белощекая и близко к поверхности панели.Примечание: В большинстве случаев, эта манипуляция оставляет базальной пластине почти нетронутыми, таким образом, не затрагивая белощекая внутри. Тщательно трещины внешней оболочки на одной стороне, вставив щипцы (рис. 3). Это делается для облегчения вскрытия fixating среды внутри корпуса.Примечание: Если оболочка не разбивается на всех перед размещением белощекая в пробирке, это может привести к медленный процесс фиксации и низкого качества ДНК позже. Положите сломанной белощекая в пробирки, содержащие РНК хранения решения или этанола. Оставьте белощекая в решение для по крайней мере 24 часа для его фиксации. Когда фиксируется белощекая, животное может из фиксации СМИ и помещены на подносе рассечение. Усиков, мантии и Сома (тело) может быть отделены друг от друга и помещены в отдельные Пробирки для дальнейшей экстракции ДНК или РНК.Примечание: Важно соблюдать, если яйцо ламели с оплодотворенные яйца присутствуют внутри белощекая. Если он присутствует, они должны быть удалены перед экстракции ДНК избегать поиска несколько генотипов в образце. Метод вскрытия B: удаление белощекая из оболочки до его фиксации.Примечание: Этот метод не всегда приводят к мантии, исследуемом методом выборки, поскольку он присоединен к внутренней calcareousshell. Но это может быть быстрый метод отбора проб ДНК от индивидуума. Тщательно удалите, с помощью рассечение щипцы, спинной и scutal пластины (рис. 3), вставив кончик щипцы между спинной и scutal плитами, схватив удерживайте пластины и потянув аккуратно удалить их. Схватить владение усиков с щипцами и тянуть белощекая прямо и поместите его непосредственно в 96% этанола или РНК, стабилизации решение для фиксации…Примечание: Иногда, мантии будут также отбираться в то же время, как видно как тонкий эпителий с темной пигментации (в б. improvisus). В противном случае мантии можно быть удалены из внутренней части корпуса с помощью скальпеля и, впоследствии, помещены в этанол или РНК, стабилизации решение.Примечание: Спинной и scutal пластин (если нетронутыми) можно сушеные и сохранены, поскольку они полезны для идентификации видов10. Общая рекомендация, если есть сомнения видов, является также сфотографировать весь белощекая до инициализации рассечение. 8. РНК добыча для количественного PCR Положить взрослых, которые будут использоваться для извлечения РНК в РНК, стабилизации решения, инкубировать их на ночь (до 24 ч) при температуре 4 ° C и затем сохранять их в-80 ° C.Примечание: Cyprid личинок преимущественно сухой замороженные, без РНК позднее непосредственно в-80 ° C, поместив их в cryotubes и затем погружаясь трубы кратко (30 s) в жидком азоте перед их сохранением в-80 ° C. В то время извлечение RNA, оттепель ракушки на льду и использование их нетронутой или вскрыть из тканей, которые будут использоваться (см. шаг 7).Примечание: из-за высокой генетического разнообразия между людьми (≈ 3 – 5% вариации в Кодирующие области; АЛМ Росенблада et al., неопубликованные данные) желательно Польша число взрослых лиц, который минимизирует влияние последовательности различия между людьми на позднем этапе ПЦР. Для RNAextraction 350 мкл буфера lysis, обеспечены подготовка комплекта РНК в гомогенизации пробирки, содержащие 2,8 мм керамический бисер.Примечание: Керамический бисер обеспечивают лучшую доходность РНК, по сравнению с sonication (Представитель результаты). Возьмите взрослых белощекая (целое или тканей) или собрать как минимум 20 cyprid личинки, с помощью щипцов и положить их в гомогенизации трубы. Приступить непосредственно к нарушение и гомогенизацию бисерная мельница. Положите гомогенизации трубы с образцом и бусы в держателе Стан шарика. Shake их с частотой 4,0 м/с для 20 s. Cool образца за 1 мин на льду. Повторите 2 x. Подготовьте РНК согласно протоколу в коммерчески доступных комплект изоляции РНК.Примечание: Оценки риска (включая чтение листы данным по безопасности) должны выполняться перед использованием методов извлечения РНК, для выявления опасных химических веществ, которые требуют использования зонта и другой защитной одежды, включая перчатки (например, Добавление β-меркаптоэтанол для литического буфера во время извлечения РНК должно выполняться в вытяжного шкафа). Количественного определения РНК. Приготовить рабочий раствор и добавить стандартного и образцы в суммарный объем 200 мкл. Vortex их за 2-3 s и инкубировать их на 2 мин Вставка трубы в флуориметр и принимать чтениях. Проверьте образцы РНК для любых белковых загрязнений с спектрофотометр и проверить их целостность РНК с системой автоматизированной электрофореза (Представитель результаты).Примечание: Для хорошего качества препаратов, РНК рекомендуется иметь отношение 260/280 Нм 2 – 2.2 и ДНК около 1.8. Более низкие значения указывают белковых загрязнений и что процедура извлечения должен быть оптимизирован. 9. ген выражение: синтез cDNA и ПЦР Рассматривать полученные RNAwith DNase для удаления любых remainingDNA прежде чем cDNA для ПЦР. Проверьте наличие загрязняющих геномной ДНК, добавив пример РНК, но не обратной транскриптазы при подготовке cDNA. Если есть PCR амплификация гена выбранного на cDNA, сделанные без обратной транскриптазы, загрязнения ДНК на РНК.Примечание: Для образцов для РНК seq (с использованием технологии следующего поколения последовательности РНК последовательности), шаг DNase менее важен. В частности, для образцов с низким уровнем РНК, DNase шаг может быть опущен в порядке, чтобы не потерять слишком много из РНК в процессе. Выполните синтез cDNA DNase лечение РНК с помощью количества РНК в диапазоне, указанном в комплект синтеза cDNA коммерческого, но как правило, использование по крайней мере 50 нг. Дизайн ПЦР праймеры, таким образом, чтобы они обжигают в частях гена интереса, где идентификатор последовательности между людьми как можно выше, но идентификатор последовательности между гена паралоги как можно более низкой. Пожалуйста, смотрите соответствующие публикации для конкретных грунт пар используется для изучения выражения гена Na+/k+ АТФаза3 и аквапоринов2 (рис. 5).Примечание: Для этой цели может использоваться РНК seq последовательность данных из сотен cyprids или несколько взрослых. Праймеры дизайн для ген использоваться для нормализации уровня выражения (например, актин). Праймеры успешно используется для актина, вперед: 5′-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3′ и обратное: 5′-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′.Примечание: Актина является геном обычно используется элемент управления. Однако другие также было предложено как ссылка и испытаны на ракушки19. Помимо актина использование RPL8, 36B4, EF1 и NADHd1 как ссылка была протестированных3. Был сделан вывод, что есть нет большого различия в уровнях выражение генов соответствующих ссылок между сома, усики, взрослых или cyprids. Оптимизируйте отжига температура для разработанных праймеры, добавляя все большее количество cDNA (обычно в диапазоне 0,25-50 нг) к смеси, содержащие SYBR зеленый, dNTP, полимеразы и 0,3 мкм прямого и обратного праймера. Запуск ПЦР протоколы при разных температурах отжига следующим: первоначальный денатурации температуры 95 ° C в течение 3 мин, шага denaturation на 95 ° C для 20 s, отжига Температура 55 – 63 ° c для 20 s и удлинения при 72 ° C для 30 s. В общей сложности запустите 40 циклов PCR.Примечание: Эффективность грунт должен лежать в диапазоне от 90-105% и рассчитываются как E = (10^(-1/slope)-1) x 100 где склона является наклон кривой, полученные при печати журнала значение концентрации cDNA против их значения порога (Ct) цикла. Выполняйте ПЦР, используя соответствующее количество cDNA, обычно 1-10 нг, используя протокол PCR, описанных в шаге 3 с оптимальной температуры отжига найдено.Примечание: Выше количество cDNA используется только для генов, которые выражаются в чрезвычайно низких объемах.