해양 모델-따개 비 Balanus improvisus 경작 및 유전자 발현

1. 새로운 Broodstock 시작 필드에서 성인 Barnacles의 수집 열가 소성 플라스틱 (폴 리 메 틸 메타 크리 레이트) 투명 패널 (1.5 m m3x 110 x 110) ≈에 1-3 m 깊이 잔잔한 필드에서 성인 barnacles를 수집 하기 위해 배포 합니다. 여러 패널 (그림 2A), 걸릴 수 있습니다 사용 하 여 프레임 각 패널 및 attachthepanelstotherackusingcableties의 위쪽 모서리에 2 구멍 (직경 6 mm)을 드릴. 따라서, thepanelswillhangverticallyin는 물입니다. Barnacles의 정착 (패널에 작은 흰색 하드 점으로 확인 된) 발생 때, 적어도 2-3 주에 barnacles 큰 있는지 확인 패널을 두고 충분 한 (5mm) 건조 또는 손상 없이 실험실에 전송. 때 그들은 캘리포니아의 크기에 도달 했습니다 정착된 B. improvisus 덮여 있다 실험실에 패널을 가져. 5 mm indiameter입니다.참고: 필드에 5mm를 개발 하는 성인을 위한 시간 높은 음식과 온도의 가용성에 따라 달라 집니다. 일반적으로,이 Tjärnö 해양 연구 실험실에서 약 3 주 소요 (58.87 ° N, 11.14 ° E). 가장 일반적으로, 새로운 broodstock 패널은 일반적으로 6 월 하순에 배포 하 고 8 월 말에서 수집. 문화 시설에 패널을 도입 하기 전에 패널에서 다른 유기 체를 청소. 그것은 가장 다른 따개 비 종 제거 하는 것이 중요입니다. 이것은 크게는 broodstock의 생존의 기회를 증가 하는 때문에, 경작 하는 동안 종 오염 제거 패널을 자주 청소 하는 것이 중요 note 하시기 바랍니다. 폴 리 에틸렌 트레이 (20 m m3x 400 x 400)에서 가공 된 홈 스탠드에 가장자리에 패널을 수직으로 배치 (그림 2C 및 2E). 스탠드에 홈 15 m m 떨어져 있습니다. 트레이 준비 하기 위해 각 용지함의 반대 측에 기지 입구 포트와 출구 포트 상단에 확인 합니다. 포함 된 약 30 L 물 20 ° C에서 오픈 해 수의 입력부와 ca의 속도에서 흐름 통해 있도록 100 L 저수지에 각 용지함의 입구 포트를 연결 합니다. 분 당 2 L입니다.참고: 8 쟁반까지 단일 100 L 저수지에 연결 했다. 해 수 온도 제어 (20 ° C) (예를 들어, 들어오는 바닷물에서 열 교환 열 펌프에 의해 제공)을 100l 저수지를 연결 합니다.참고:는 따개 비 B. improvisus 성장 하 고 전체 해양 염 분 (30-35 psu);에서 재현 그러나, ca에 염 분 감소. 100 L 저수지에 민물을 추가 하 여 25 psu 문화에서 애벌레의 출력을 증가 시킵니다. 2. 교양된 Cyprids에서 어른 들의 새로운 세대를 시작 열가 소성 패널 상단에 오픈 테이 핑 5 패널 함께 비 독성, 방수 테이프를 사용 하 여 큐브를 생성 합니다. (누설)의 경우 작은 쟁반에서 큐브를 놓고 바닷물 (25 psu)와 그것을 채우기. 실 온에서 물을 유지 (ca. 20 ° C). 큐브의 상단에 대략 200 cyprids를 추가 합니다. 먹이 청소년 100 mL Skeletonema marinoi 의 매일 (단계 5 참조) 큐브에 있는 동안.참고: 청소년 barnacles Artemia 살 리 나 를 복용 함께 어려움을 가질 수 있습니다 (3 단계 참조) 그들은 크고, 따라서, 새로 정착된 따개 비에 대 한 소화 하기 어려운. 주 x 물 1을 변경 합니다. 2 주 후 때 패널 포함 적어도 5 mm 직경에서의 충분히 설립된 청소년, 큐브를 분해 흐름-throughseawater와 함께 쟁반에는 청소년으로 패널을 이동 고, 그 후, A. 살 nauplii에 barnacles 피드. 3. 문화 Nauplii Artemia 살 리 나 의 Barnacles 성인에 대 한 피드 어디는 bottomis 고 병 서에 거꾸로 하 고 측면에서 조명 배치는 1.5 L 플라스틱 병을 사용 하 여 A. 살 리 나 에 대 한 자란 시스템을 설정 합니다. 실리콘 튜브에 병목을 클램프를 맞지 고 폭 기 펌프 (그림 2D)에 연결 합니다. 계란 해치, 하려면 1 L ofseawater를 Artemia 의 건조 휴식 계란의 약 15 mL를 추가 합니다.참고: Artemia 계란 해치 후 24-48 h nauplius 애벌레로. A. 살 nauplii (예를 들어, 주말 동안)의 부 화를 지연, 빛을 약간 온도 줄이기 위해 해제 수 있습니다. Artemia nauplii, 수확 하는 통 기 통풍을 해제 하 고 알루미늄 호 일 (또는 유사한 예를 들어수)와 함께 병의 상단 부분 어둡게… 켜 10 분 Hatched Artemia nauplii에 대 한 병의 아래 부분에 빛을 향해 수영 것입니다. 비 부 화 cysts는 하단 싱크대 것 이다 그리고 낭종 껍질 표면에 플 로트 것입니다. 하단에 클램프를 엽니다. 수영 nauplii의 인구 밀도로 중간 부분을 수집 합니다.참고: 매일 (주말 제외), 조밀한 Artemia nauplii 서 스 펜 션의 1 L 성인 barnacles와 쟁반에 연결 100 L 저수지에 수동으로 추가 되었습니다. 이후 그들은 영양을 제공 하지 않습니다 주로 문화 더 자주 청소 해야 될 빈 알 껍질, 어떤 먹이 하지 마십시오. 4. 수집 및 따개 비 애벌레의 양육 부드럽게 민물로 그들을 분사 하 여 성인 barnacles와 패널을 청소 하 고, 필요한 경우 따개 비 조개와 부드러운 칫 솔을 사용 하 여 패널에서 모든 파울 제거. 또한, 트레이 (barnacles) 없이 뜨거운 (75 ° C)에 튜브를 청소 민물. 90 µ m 플랑크톤-그물 컷된 PVC 파이프 (16 cm 직경, 높이 15 cm)의 끝에 붙어 만들어진 체를 오버플로 포트와 폴 리 에틸렌 트레이 (30 x 20 x 10 cm3)에 넣으십시오. 밤새 체 (그림 2C) B. improvisus 애벌레를 수집 합니다.참고: 체 outflowing 물을 고는 nauplii 걸러 따개 비 패널의 쟁반의 출구 포트 바로 아래 위치 했다. 애벌레는 바닷물 범람 작은 트레이 동안 체에서 남아 있었다. 이 작은 트레이 보장 하는 체 하지 driedout. 큰 물 욕조에 30 L 물통을 장소 온도 수족관 물고기 탱크 히터 (그림 2E)를 사용 하 여 26 ° C에서 유지 됩니다. 폭 기 및 교 반 시스템을 통해 공기 버블링에 의해 보장 됩니다. 필터링 된 바닷물 (0.2 µ m; 25 psu)의 20 L로 양동이를 채우십시오. 2 규조류 microalgae, S. marinoi , C. gracilis (단계 5 참조)의 60/40 혼합 양동이에 1 L를 추가 합니다. 이 양동이에 mL 당 약 5 x 104 규조류의 초기 밀도 줄 것 이다.참고: 따개 비 nauplii 애벌레는 긍정적으로 phototactic. 양동이 불투명 흰색 플라스틱 뚜껑 있는 몇 가지 빛을 통해 만들어졌다. 겨울 동안 방 야간 동안 어두운 하지만 (8시 ~ 17:00), 낮 조명 했다. 여름 동안에, 외부 빛 하루의 대부분 동안 방에 들어왔다. 수집 전송 crystallizing 접시 (300 mL, 직경에서 90 mm, 높이 50mm) B. improvisus nauplii. 밝게 광원에 유 충을 끌 것 이다 측면에서 요리. 피 펫으로 들어오는 빛에 모이고 다른 crystallizing 접시에 그들을 전송 하는 따개 비 nauplii 수집 합니다. 모든 나머지 Artemia 애벌레를 제거 합니다. 필터링 된 바닷물의 1 L와 비 커에 B. improvisus nauplii 애벌레를 전송. 애벌레도 정지를 부드럽게 비 커를 교 반 하 고 다음 비 커에 다른 장소에서 5 1 mL 샘플을 복용 하 여 nauplii의 수를 계산. stereomicroscope와 시각적 검사에 대 한 미 판으로 각 샘플을 전송 합니다. 5 샘플의 각 nauplii의 수를 계산 하 고 그들을 추가. 200 (1000 mL/5 mL) 전체 비 커에는 애벌레의 얼마나 많은 수천을 추정 하 여 계산된 수를 곱하면. 비 커에 너무 많은 nauplius 애벌레 경우 밀도 최대 14000 애벌레/L (11000-12000 애벌레/L의 범위)에 보통 때까지 샘플을 희석. 따라서 추가 통 당 약 11000-12000 애벌레 한 양동이에 B. improvisus nauplii의 1 L를 추가 합니다.참고:이 애벌레에 관하여 너무 작은 식품에 발생 되며, 따라서, 사망률을 증가 더 많은 nauplii, 추가 하지 않도록 확인 합니다. 3 일 후, 따개 비 nauplii 90 µ m 체에 수집 합니다. 청소 (75 ° C를 가진 민물), 양동이 필터링된 해 그것을 채울, 새로운 규조류 피드 (동일한 금액으로 시작), 추가 그리고 마지막으로 다시는 nauplii 추가. Cyprids (± 1 일) 약 6 일 후 나타나는 시작 합니다. 먼저 90 µ m 체 (포인트 4.2 위 에서처럼 설계)와 cyprids를 수집 합니다. 다음은 160 µ m 체 위에 320 µ m 체 비 moulted 따개 비 nauplii 및 cyprids 구분 합니다. B. improvisus nauplii 320 µ m 체와 160 µ m 체에서 cyprids에서 수집 합니다.참고: cyprid 애벌레 저장할 수 있습니다 crystallizing 접시에 10 ° C에서 캘리포니아까지 나중 사용을 위해 어둠 속에서. 6 일입니다. 그러나, 저장 수에 영향을 따개 비 애벌레의 성능과 품질 그래서 다른 처리를 비교 하는 실험 이상적으로 혼란 효과16을 피하기 위해 동일한 배치 (와 유사한 저장 시간)에서 애벌레를 사용 해야 합니다. 5. 문화 따개 비 Nauplius 애벌레에 대 한 피드로 미세 참고: 조류는 3 가지 종류의 문화에서 성장 했다: (i) 문화, 스케일-업;의 접종에 대 한 사용 되 고 긴장의 장기적인 유지 관리에 대 한 재고 (ii) 시작 문화, 스케일 업;의 첫 번째 단계는 그리고 마지막으로 (iii) 따개 비로 많은 양의 해 조류의 최종 생산 규모 생산 문화의 피드. 따개 비 nauplius 애벌레 먹이로 사용 되는 문화 컬렉션의 조류 및 원생 동물 (CCAP)에서 규조류 종 주문. 2 종 Skeletonema marinoi (CCAP 스트레인 1077/5) 및 Chaetoceros 단순 var. gracilis (CCAP 스트레인 1085/3) 피드로 좋은 결과 줄. 카트리지 필터 시스템을 사용 하 여 0.2 µ m. (필터링 된 해 수는 A. 살 리 나 계란의 부 화와 따개 비 nauplius 애벌레의 배양에 사용할 또한.) 공칭 기 공 크기와 조류 문화에 사용 되는 모든 해 수 필터링 압력솥 (5 분 동안 105 ° C)에서 조류 문화에 대 한 필터링 된 해 수. 미세, 무기 영양소, 추적, 금속과 비타민 (Guillard 197517 자세한 제조 법에 대 한 참조)를 포함 하는 Guillard의 f/2 솔루션과 농축 압력가 해 수를 사용 하 여 문화에 대 한 매체를 준비 합니다. 또한, 규 산 염 (Na23SiO) 솔루션을 준비 하지만이 단단한 강 수를 방지 하기 위해 f/2 농축에서 별도 유지.참고: 농축 재고 솔루션 및 규 산 염의 재고 솔루션의 농도 바닷물의 1 l 각의 1 mL 추가로 사용할 준비 되었다. 압력솥 모든 장비는 1 mL f/2 농축의 고 규 산 염 솔루션의 1 mL와 20 분 압력솥 나사 출장 테스트 튜브에 대 한 120 ° C에서 조류 문화에서 사용. 압력가 유리와 액체는 실내 온도 냉각 하는 때 theseawater를 농축 및 규 산 염 솔루션을 추가 합니다. 나사 모자 40 mL 시험관에서 microalgae의 사진 문화를 성장. 테스트 튜브를 농축된 해 수의 약 30 mL에 채워 넣어 라. 2 주 오래 된 재고 문화의 대략 1 개 mL를 사용 하 여 살 균 파스퇴르 피 펫과 문화를 예방. 나사 모자 다음 장착 하지만 일부 가스 교환을 허용 하지 강화. 사용 가능한 경우는 접종 오염의 위험을 줄이기 위해 캐비닛 층 흐름에 밖으로 실행 되어야 한다.참고: 재고 문화의 목적은 조류 문화 장기 기초에 대 한 inoculum을 시작 문화를 유지 하는 것입니다. 재고 문화 다시 매 2 주를 주사 했다. Ca의 진도 하얀 빛을 새로운 사진 문화를 노출 합니다. 25-50 µmole m-2의-1 (16:8 h의 빛-어두운 주기)와. 오래 된 재고 문화 낮은 빛의 강도 백업으로 이동 합니다. 모든 2 주 오래 된 재고 문화를 삭제 합니다. 스케일링 해 조류의 생산 문화, 주식 문화에서 시작 문화를 접종 하 고 500 mL Erlenmeyerflasks에에서 그들을 성장. 압력솥 4 삼각 플라스 크, 펫 필터링된 (0.2 µ m) 바닷물의 300 mL와 함께 면 stoppers 그리고 f/2 농축의 0.3 mL와 4 테스트 튜브 및 규 산 염 솔루션 4. F/2 농축 및 실내 온도에 규 산 염을 진정 하 고 삼각 플라스 크에 솔루션을 추가 합니다. Ca와 그들을 예방. 2 주 오래 된 재고 문화의 1 mL참고: S. marinoi 와 2 플라스 크와 C. 심 플렉스2 준비 합니다. 50 µmole m-2의-1의 빛의 강도에 떨고 테이블에는 플라스 크를 넣어. 시작 문화 조류 인구 밀집 (노란색-갈색 색상) 획득 때 그들은 제공 하는 것입니다는 따개 비 애벌레 음식 생산 문화 inoculum으로 사용할 준비가 되었습니다. 유리 튜브 장착 2 드릴 포트 4 L 폴 리 탄산염 병 실리콘 stoppers에서에서 생산 문화를 성장. 공기 펌프를 통해 실리콘 튜브 0.2 µ m에 어 필터를 장착 하는 병의 바닥에 도달 하는 1 유리 튜브를 연결 합니다. 두 번째 유리 튜브 끝 바로 아래 실리콘 스 토퍼 및 주입된 공기 출구를 허용 하는 면으로 가득 차 있는지 확인 합니다. 각 주, 채우기 4 4 L 병 필터링된 해 수와 압력솥 그들은 stoppers 함께. 또한, 압력솥 4 테스트 튜브 f/2 농축 및 규 산 염 솔루션 4 mL와 함께 합니다. 냉각 후, 병에 f/2 농축 및 규 산 염 솔루션을 추가 하 고 삼각 플라스 크에 시작 문화의 볼륨의 절반을 함께 접종 합니다. 50-100 µmole m-2의-1의 빛의 강도에 4 4 병을 놓습니다. Ca후 생산 문화를 수확. 1 주; 그들은 충분히 밀도 따개 비 nauplius 애벌레를 먹이 기를 위해 사용할 수 있습니다.참고: 생산 문화 있다 언제 든 지 8 활성 프로덕션 병은 약 2 주의 수명. 6. 설계 Barnacles를 사용 하 여 실험 연구 청소년 또는 성인 barnacles 패널 제어 aquaria 어디 그들은 identicalconditions에서 성장 될 수 있다 장소. 이것은, 예를 들어, 사용 될 수 있는 현지 적응 또는 phenotypic가 소성18이해 하거나 외부 요인 (예, 염 분, 온도, 또는 pH) 관련 유전자 표현 변화를 공부 하는 공통 정원 실험 이라고.참고: 그것은 또한 barnacles 직접 패널에 현장에서 수집 된를 사용 하 여입니다. 실험실 사육 개인 사용의 장점은 자손의 다음 세대를 사용 하 여 때 모성 효과 피할 수 있습니다. 성인 (예를 들어, 유전자 발현에 대 한 연구에 대 한)의 수확 뒤에 chosentime 간격 동안 특정 환경 조건에 barnacles 노출2. Cyprid 유 충 진 식3공부와 실험에 대 한 제어 aquaria 애벌레 동일한 조건 하에서 재배 하는 수 있는 곳에 cyprids를 놓습니다. 체 (단계 4.7에서에서와 같이)로 필터링 하 여 지정한 기간 후에 cyprids을 수확 하 고 프로토콜 아래 (8 단계)에 따라 RNA를 추출 합니다. 7입니다. Barnacles의 해 부 실험실 공간 어디 해 부 및 DNA 샘플링 수행 됩니다, bothbefore 청소와 개인 사이, 모든 해 부 도구를 포함 하 여. 이렇게 벤치 (또는 96% 에탄올은 겸 자에 대 한)에 대 한 염소를 사용 하 여.참고: 이라는 튜브 고정 미디어 (에탄올 또는 RNA 안정화 솔루션)를 포함 하는 사전에 준비 된다. 크고 단기 굶 어 개인 (먹 여 살리지 못하면 그들 2 일전 해 부에 대 한)을 선택 합니다. 따개 비 쉘 (예를 들면, 박테리아, 조류) 다른 종에서 오염 위험을 최소화 하 고 물으로 그것을 씻어에 칫 솔을 청소.참고: 해 부 하기 전에 개인의 단기 기아에 대 한 이유 (예를 들어, Artemia cysts 용기에서에서) 어떤 DNA 오염을 방지 하는. 개별 barnacles도 표면, 패널에 연결 된 또는 느슨한 접시에에 놓습니다. 성인에서 각각 조직 해 부. 해 부 barnacles, 연구의 목적에 따라 여러 가지가 있습니다. 해 부 방법 a: 전체 따개 비를 최대한 빨리 해결. 따개 비 아래 삽입 패널 표면 가까이, 메스를 사용 하 여 패널에서 전체 따개 비를 제거 합니다.참고: 대부분의 경우에서이 조작 나뭇잎 기저 판 거의 그대로 따라서 하지에 영향을 미치는 내부 따개 비. 조심 스럽게 집게 (그림 3)를 삽입 하 여 한쪽에 외피를 균열. 이 쉘 내부 fixating 매체의 침입을 용이 하 게 수행 됩니다.참고: 경우 껍질은 하지 전혀 테스트 튜브에는 따개 비를 배치 하기 전에, 그것은 느린 고정 프로세스 품질과 열 등 DNA의 나중에 발생할 수 있습니다. 깨진된 따개 비 RNA 스토리지 솔루션 또는 에탄올을 포함 하는 테스트 튜브에 넣어. 적어도 24 h의 고정을 위한 솔루션에는 따개 비를 둡니다. 따개 비 고정 때 동물 반출 고정 미디어 고 해 부 트레이에 배치 수 있습니다. Cirri, 맨 틀, 그리고 소마 (몸)을 서로에서 분리 하 고 추가 DNA 또는 RNA의 추출에 대 한 별도 튜브에 배치 수 있습니다.참고: 그것은 수정 된 계란 계란 lamellae는 따개 비 안에 존재 하는 경우를 관찰 하는 것이 중요입니다. 있는 경우 이러한 샘플에 여러 genotypes을 찾는 피하려고 DNA 추출을 진행 하기 전에 제거 되어야 한다. 해 부 방법 b: 그것의 고정 하기 전에 셸에서 따개 비를 제거.참고:이 메서드는 calcareousshell의 내부에 붙어 있기 때문에 샘플링 되는 맨 틀에서 항상 발생할 하지 않을 수 있습니다. 하지만 그것은 개인에서 DNA를 샘플링 하는 빠른 방법 될 수 있습니다. 조심 스럽게 사용 하 해 부 집게, tergal 및 scutal 플레이트 (그림 3) 여 tergal 및 scutal 판 사이의 집게의 끝을 삽입, 접시, 잡고 잡아 당겨 부드럽게 그들을 제거 하 여 제거 합니다. 잡아는 cirri의 집게와 풀은 따개 비 바로 밖으로 누른 96% 에탄올 또는 고정을 위한 솔루션을 안정화 하는 RNA에 직접 배치.참고: 때때로, 맨 틀 것입니다 또한 수 샘플링 같은 시간에 본 ( B. improvisus)에 어두운 색소와 얇은 상피로. 그렇지 않으면, 맨 틀 수 있는 메스를 사용 하 여 셸 내부에서 제거 되며, 그 후, 에탄올 또는 RNA 안정화 솔루션에 배치.참고: tergal, scutal 접시 (그대로) 경우 건조 고 이후 그들은 종 식별10유용한 저장 될 수 있습니다. 일반 추천, 종, 어떤 의심 하는 경우 초기화 해 부 하기 전에 전체 따개 비 사진입니다. 8. 정량 PCR 위한 RNA 추출 RNA 추출 솔루션 안정화는 RNA로 데 성인 4 ° C에서 하룻밤 (24 h)까지 그들을 품 어 넣고-80 ° c.에서 그들을 저장합니다참고: Cyprid 애벌레는 우선적으로 드라이-냉동, RNA-80 ° C에 직접 저장 하지 않고 cryotubes에서 그들을 배치 하 고 다음 튜브를 짧게 물속 여 (30 s)-80 ° c.에서 그들을 저장 하기 전에 액체 질소 RNA 추출 시 barnacles 얼음에 녹여 고 그들을 그대로 사용 하거나 사용할 조직 밖으로 해 부 (7 단계 참조).참고: 개인 (코딩 영역; ≈ 3-5% 변형 간의 높은 유전적 다양성으로 인해 Alm Rosenblad 그 외 여러분, 게시 되지 않은 데이터) 그것은 폴랜드의 수 성인 개인 정량 나중 단계에서 개인 간의 순서 변이의 영향을 최소화 하는 것이 좋습니다. RNAextraction, 균질 튜브 세라믹 구슬의 2.8 m m를 포함 하는 RNA 준비 키트와 함께 제공 되는 세포의 용 해 버퍼의 350 µ L를 추가 합니다.참고: 세라믹 구슬 쥡니다 (대표 결과)에 비해 RNA의 더 나은 수익률을 제공 합니다. 성인 따개 비 (전체 또는 조직)를가지고 또는 최소 20 cyprid 애벌레 집게를 사용 하 여 수집 하 고 균질 튜브에 넣어. 비드 밀 중단 및 균질 화에 직접 진행. 비드 밀 홀더에서 샘플 및 구슬 균질 튜브를 넣어. 흔들어 그들 4.0 m/s의 주파수 20 s. 쿨 얼음에 1 분에 대 한 샘플. 2 배를 반복 합니다. 상업적으로 이용 가능한 RNA 격리 키트의 프로토콜에 따라 RNA를 준비 합니다.참고: 위험 평가 (를 포함 하 여 안전 데이터 시트 읽기)는 RNA 추출 방법, 증기 두건 및 다른 보호복, (예를 들어, 장갑 등의 사용을 필요로 하는 유해 화학 물질을 식별 하기 위해 사용 하기 전에 수행 되어야 한다 RNA 추출 중 β-mercaptoethanol 세포의 용 해 버퍼를 추가 수행 되어야 한다 증기 두건에서). RNA를 계량. 작업 솔루션을 준비 하 고 표준 및 샘플 200 µ L.의 총 볼륨을 추가 동 2-3 s에 대 한 그들 품 어 그들 2 분 삽입에 대 한 튜브를 fluorometer로 하 고 판독. 분 광 광도 계, 어떤 단백질 오염에 대 한 RNA 샘플 확인 하 고 자동된 전기 영동 시스템 (대표 결과)와 그들의 RNA 무결성 검사.참고: 좋은 품질 준비, RNA는 것이 좋습니다 260/280의 비율을 2-2.2와 약 1.8의 DNA의 nm. 낮은 값 단백질 오염 및 추출 절차 최적화는 나타냅니다. 9. 유전자 발현: cDNA 합성 및 정량 정량에 대 한 cDNA를 하기 전에 어떤 remainingDNA를 제거 하려면 취득된 RNAwith DNase를 처리 합니다. 게놈 DNA를 cDNA를 준비할 때 RNA 샘플 하지만 아무 역전사를 추가 하 여 오염에 대 한 확인 합니다. 역전사 없이 cDNA에 선택 된 유전자의 PCR 증폭 경우에, RNA에서 DNA 오염이입니다.참고: RNA-seq (RNA 시퀀싱 차세대 시퀀싱 기술을 사용 하 여)에 사용 될 샘플, DNase 단계는 덜 중요 한. 특히, RNA의 낮은 수준 샘플, DNase 단계 수도에서 생략할 수 잃기 위하여 과정에서 RNA의 너무 많이. 상업 cDNA 합성 키트, 하지만 일반적으로, 사용 적어도 50 ng에 지정 된 범위 내에서 RNA의 금액을 사용 하 여 DNase 취급 RNA에 cDNA 합성을 수행 합니다. 그들은 개인 간의 시퀀스 id는 최대한 높은 하지만 유전자 paralogs 사이 시퀀스 id 가능한 관심사의 유전자의 anneal 정량 Pcr 뇌관 디자인. 특정 뇌관 쌍 진 식 연구 나+의 사용에 대 한 해당 간행물을 보십시오 /K+ ATPase3 및 aquaporins2 (그림 5).참고:이 목적을 위해 cyprids의 수백 또는 여러 성인에서 RNA-seq 시퀀스 데이터 사용할 수 있습니다. 식 수준 (예를 들어, 말라)의 정규화에 사용할 유전자를 위한 뇌관 디자인. 말라에 성공적으로 사용 하는 뇌관은, 앞으로: 5′-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3’와 역: 5′-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′.참고: 말라 통용 제어 유전자 이다. 그러나, 다른 사람 또한 되었습니다 기준으로 제안 있고 barnacles19에 밖으로 테스트. 말라, 외 기준으로 RPL8, 36B4, EF1, 및 NADHd1의 사용은 테스트3되었습니다. 그것은 soma, cirri, 성인, 또는 cyprids 각각 참조 유전자의 표현 수준에 큰 차이가 있다 체결 했다. (일반적으로 0.25-50 ng의 범위)에서 cDNA의 증가 금액 SYBR 녹색, dNTP, 중 합 효소, 그리고 0.3 µ M 각 정방향 및 역방향 뇌관의 혼합에 추가 하 여 설계 된 뇌관의 어 닐 링 온도 최적화 합니다. 다른 어 닐 링 온도에서 정량 Pcr 프로토콜을 다음과 같이 실행: 3 분 동안 95 ° C, 20 ° c에서 95 변성 단계의 초기 변성 온도 20 55-63 ° C의 온도 어 닐 링 s, s, 및 30에 대 한 72 ° C에서 신장 s. 총에서 40 PCR 주기를 실행 합니다.참고: 뇌관 효율성 90-105%의 범위에 거짓말을 해야 하 고 E로 계산 = (10^(-1/slope)-1) x 100 기울기가 그들의 주기 (Ct) 임계값에 대 한 cDNA 농도의 로그 값을 플롯할 때 얻은 곡선의 기울기. 정량 Pcr cDNA, 발견 하는 최적의 어 닐 링 온도와 3 단계에 설명 된 PCR 프로토콜을 사용 하 여 일반적으로 1-10 ng의 적절 한 금액을 사용 하 여 수행 합니다.참고: cDNA의 더 높은 양은 매우 낮은 금액에 표현 되는 유전자에만 사용 됩니다.