Манипулируя живых клеток для построения стабильной 3D сотовой Ассамблеи без искусственных лесов

1. Подготовка клеток Поддерживать NAMRU мыши молочной железы эпителиальных клеток (NMuMG) с 5 мл D-MEM содержащие 10% (v) плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% (v) пенициллин-стрептомицином (P/S) в колбе3 25 см. Удаление Дульбекко изменение средних орла (D-MEM), содержащие 10% FBS и 1% P/S. Добавьте 3-5 мл физиологического раствора фосфатного буфера 37 ° C (PBS) (-) в колбу. Обратите внимание, что рН PBS является 7.1-7.3. Удалите все PBS из колбы, используя отсос. Добавьте 1,5 мл трипсина 37 ° C (0,25%, w/v) в колбу. Инкубируйте Фляга для примерно 1-2 минут при 37 ° C в инкубатор CO2 . Добавить 3,5 мл D-MEM, содержащие 10% FBS и 1% P/S в колбу. Пипетка для смешивания. Передать пластиковых пробирок 15 мл суспензии клеток и центрифуги на 3 мин при комнатной температуре. Обратите внимание, что радиус вращения и скорость вращения центрифуги, 16,6 см и 1500 об/мин, соответственно. При этом условии относительная центробежная сила — 417 x g. Добавьте 5 мл свежего D-MEM (10% FBS и 1% P/S) на колбу после аспирационных носитель (если требуется, криоконсервации клеток с криоконсервирования решения, следуя инструкциям производителя). 2. Подготовка декстрана (DEX) Подготовка 80 мг/мл раствора DEX путем смешивания 10 мл D-MEM (10% FBS, 1%P/S) и 0,8 г DEX. Обратите внимание, что решение DEX могут быть отфильтрованы с помощью шприца фильтра (0.22 мкм) после того, как клетки культивировали в течение достаточного времени. Готовят суспензию клеток, содержащих 40 мг/мл DEX среднего, смешивая 200 мкл раствора DEX и 200 мкл суспензии клеток, подготовленный в 2.1. Обратите внимание, что количество плотность клеток в решении приблизительно 2.3 × 105 кл/мл. 3. подготовка для лазерных и микроскопия Включите лазер (непрерывная волна, волны 1064 нм)(рисунок 1). Обратите внимание, что использование лазерный луч с длиной волны в красном в ближней ИК-области регион является наиболее эффективным; Этот регион волны называют диагностического и терапевтического окна10 , так как она минимально поглощается клетками. Дважды щелкните значок программного обеспечения. Дважды щелкните Изменить значки для камеры ① ② светоизлучающих диодов (СИД), ③ фокус и ④ перемещение стадии. Отображает соответствующий ①-④ покажет вверх (рис. 1б). 4. Сотовый манипуляции с использованием лазерной системы улавливания Место 20 мкл образца, подготовленный на шаге 2.2 на нижней крышки стекла (0,17 мм толщина, размер = 30 × 40 мм) и покрыть ее с верхней крышки стекла (0,17 мм толщина, размер = 18 × 18 мм), с разделением, предоставляемые две распорки (0,17 мм толщина Размер = 10 × 24 мм), как показано на рисунке 2. Обратите внимание, что эти очки не требуют специального покрытия. Поместите образец клеток, подготовленный на этапе 4.1 на нижнем объектива (водные погружения с ca. 10 мкл, масштаб = 60 X, рабочее расстояние = 0,28 мм, числовая апертура = 1.2)). Прикрепите верхнюю объектива (водные погружения с ca. 10 мкл, масштаб = 60 X, рабочее расстояние = 2 мм, числовая апертура = 1,0) в верхней части ячейки выборки. Включите светодиод свет, нажав значок 2 (рис. 1б). Отрегулируйте расстояние между образцом и нижней объектива, нажав значки на панели 3 (рис. 1б) до тех пор, пока он находится в фокусе. Облучить лазерных лучей на позиции 1 и 2 (рис. 1Б) позицию выборки, нажав значки I, II и III (рис. 1б). Установите необходимую интенсивность каждого лазерного пучка до 1500 МВт, введя значение в значок IV (рис. 1б). Перемещение образцов этап, нажав значок 4 указанием направления (рис. 1б) до ячейки удерживается на позиции 1 (рис. 1б). Перетащите курсор, указывающий положение 2 (рис. 1б) до другой ячейки в ловушке в позиции 2. 5. строительство 3-мерные (3D) клеточной структуры Манипулировать одну ячейку, так что это контакт с другой ячейки. Сохранить это состояние для 300 s; то есть, каждая клетка подвергается воздействию лазера для 300 s. Запишите оси X-Y, показано на рисунке 1b. Постройте сборку произвольных 2D клеток путем улавливания и транспортировки другую ячейку в клетки. Постройте сборку 3D сотовой, перемещая вверх и вниз на стадии. Подтвердите, что Ассамблея остается стабильным после выключения лазера.