인공 비 계 없이 안정적인 3D 셀룰러 어셈블리를 생성 하는 살아있는 세포를 조작

1입니다. 셀의 준비 D-MEM 포함 10% (v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% (v) 25 cm3 플라스 크에서 페니실린-스 (P/S)의 5 mL와 함께 NAMRU 마우스 유선 상피 세포 (NMuMG)를 유지 합니다. 제거 Dulbecco의 수정이 글의 매체 (D-MEM), 10 S 및 1% 포함 된 P/s. 플라스 크를 37 ° C 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (-)의 3-5 mL를 추가 합니다. 참고 PBS의 pH 7.1-7.3 이다. 흡 인기를 사용 하 여 플라스 크에서 모든 PBS를 제거 합니다. 플라스 크를 37 ° C의 트립 신 (0.25%, w/v)의 1.5 mL를 추가 합니다. CO2 배양 기에서 37 ° C에서 약 1-2 분 동안 플라스 크를 품 어. 추가 10 S 및 1% 포함 된 D-MEM의 3.5 mL 플라스 크에 P/S. 혼합 피 펫입니다. 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 실내 온도에 3 분 동안 원심. Note는 회전 반경 및는 원심 분리기의 회전 속도 16.6 c m 및 1500 rpm, 각각. 이 조건 하에서 상대 원심력 417 x g 이다. 신선한 D-MEM의 5 mL을 추가 (10 S 1 %P / S) 매체 발음 후 플라스 크를 (필요한 경우 cryopreserve cryopreservation 솔루션, 제조자의 방향 다음 셀). 2입니다. Dextran (덱 스)의 준비 D-MEM의 10 mL를 혼합 하 여 80 mg/mL 덱 스 솔루션의 준비 (10 S, 1%P/S)과 덱 스의 0.8 g. 덱 스 솔루션 주사기 필터 (0.22 μ m)으로 필터링 할 수 있습니다 참고 세포는 충분 한 시간 동안 배양 한 후. 덱 스 솔루션의 200 µ L 및 2.1에 세포 현 탁 액의 200 µ L를 혼합 하 여 40 mg/mL DEX 매체를 포함 하는 셀 서 스 펜 션 준비. 솔루션에는 셀의 수 조밀도 약 2.3 × 105 셀/mL. 3입니다. 레이저 및 현미경 검사 법에 대비 하 여 레이저 (연속 웨이브, 1,064 nm 파장) 설정 (그림 1a). 근 적외선 영역에 빨간색에서 파장을 가진 레이저 광선의 사용은 가장 효과적인; 그것은 최소한 세포에 의해 흡수 이후이 파장 영역 진단 및 치료 창10 이라고 합니다. 소프트웨어 아이콘을 두 번 누릅니다. ① 카메라, ② 발광 다이오드 (LED), ③ 초점에 대 한 아이콘 조정, 두 번 클릭 하 고 ④ 단계 이동. ①-④에 해당 하는 표시 (그림 1b) 표시 됩니다. 4. 셀 조작 레이저 트랩 시스템을 사용 하 여 하단 커버 유리에 2.2 단계에서 준비 하는 샘플의 장소 20 µ L (0.17 m m 두께, 크기 = 30 m m × 40 m m), 상단 덮개 유리 커버 (0.17 m m 두께, 크기 18 × 18mm =), 두 명의 스페이서 (0.17 m m 두께에서 제공 하는 분리 크기 = 10 m m × 24 m m), 그림 2와 같이. 참고 이러한 안경 특별 한 코팅을 필요 하지 않습니다. 4.1 낮은 대물 렌즈에 단계에서 준비 된 샘플 셀 배치 (ca. 10 μ, 확대와 침수 물 = 60 X, 작동 거리 0.28 m m, 조리개 수치 = = 1.2)). 위 대물 렌즈를 연결 (ca. 10 μ, 확대와 침수 물 = 60 X, 작동 거리 2 m m, 조리개 수치 = = 1.0) 샘플 셀의 상단에. 설정 LED 조명 아이콘 2 (그림 1b)를 클릭 하 여. 패널 3 (그림 1b)에 있는 아이콘을 클릭 하 여 샘플 및 낮은 대물 렌즈 사이의 거리를 조정 초점에 때까지. I, II, 및 III (그림 1b) 아이콘을 클릭 하 여 위치 1과 샘플의 위치 2 (그림 1B)에서 레이저 광선을 비추는. 1500 각 레이저 광선의 강도 설정 아이콘 IV (그림 1b)에서이 값을 입력 하 여 mW. 셀까지 아이콘 4 나타내는 방향 (그림 1b)를 클릭 하 여 샘플 단계 위치 1 (그림 1b)에 갇혀 이동 합니다. 다른 셀까지 위치 2 (그림 1b)를 나타내는 커서 위치 2에 갇혀 드래그 합니다. 5. 건설의 3 차원 (3D) 셀 구조 단일 셀 다른 셀에 접촉 되도록 조작할 수 있습니다. 300이 상태 유지 s; 즉, 300 레이저에 노출 되는 각 셀 s. 그림 1b에 표시 된 X-Y 축을 기록 합니다. 트래핑 및 셀을 다른 셀을 운반 하 여 임의의 2D 셀 어셈블리를 생성 합니다. 무대를 아래로 이동 하 여 3 차원 세포 어셈블리를 생성 합니다. 어셈블리는 레이저 스위치 off 후 안정적인 유지 확인 합니다.