人工足場なしの安定した 3 D 携帯電話アセンブリを構築する細胞を操作します。

1. 細胞の調製 D MEM 含む 10% (v) ウシ胎児血清 (FBS) の 1% (v) ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S) 25 cm3フラスコ 5 mL と NAMRU マウス乳腺上皮細胞 (NMuMG 細胞) を維持します。削除ダルベッコ修飾イーグル培地 (D-MEM)、10 s および 1% を含む P/s. 37 ° C リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (-) 3-5 mL をフラスコに追加します。PBS の pH が 7.1 7.3 であることに注意してください。 アスピレーターを使用してフラスコからすべての PBS を削除します。 37 ° C トリプシン 0.25% (w/v) 1.5 mL をフラスコに追加します。 フラスコ CO2インキュベーターで 37 ° C で約 1-2 分間インキュベートします。 追加 10 s および 1% を含む D MEM の 3.5 mL フラスコに P/S。ピペットをミックスします。 15 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送し、室温で 3 分間遠心します。回転半径と遠心分離機の回転速度は、16.6 cm 1500 rpm、それぞれに注意してください。この条件の下で相対的なの遠心力は 417 x g です。 新鮮な D MEM の 5 mL を追加 (10 s と 1 %p/S) 培地を吸引後フラスコに (必要な場合、凍結細胞凍結保存ソリューションで、製造元の指示に従って)。 2. デキストラン (DEX) の準備 D MEM の 10 mL を混合することによって DEX 液 80 mg/mL を準備 (10 s、1%P/S) と DEX の 0.8 グラム。シリンジ フィルター (0.22 μ m) でフィルター処理することができますは DEX ソリューション、細胞が十分な時間培養した後。 DEX 溶液 200 μ L と 2.1 で作製した細胞懸濁液 200 μ L を混合することによって 40 mg/mL DEX 媒体を含んでいる細胞懸濁液を準備します。ソリューション内のセルの数密度は約 2.3 × 105セル/mL。 3. レーザー、顕微鏡のための準備 (連続波、1,064 nm) のレーザーを入れます (図 1、)。赤色近赤外領域からの波長を持つレーザー光の使用が最も効果的なことに注意してください。この領域の波長は、それは最低限細胞に吸収されるので診断と治療ウィンドウ10と呼ばれます。 ソフトウェア アイコンをダブルクリックします。 (1) カメラ、(2) 発光ダイオード (LED)、(3) フォーカス アイコンを調整をダブルクリック、(4) ステージを移動します。(1)-(4) に対応するが表示されますが表示されます (図 1b)。 4 レーザー トラップ システムを使用して細胞操作 手順 2.2 下のカバーガラス上で調製した試料の場所 20 μ L (厚さ 0.17 mm、サイズ = 30 mm × 40 mm)、トップ カバー ガラスでカバー (厚さ 0.17 mm、サイズ = 18 mm × 18 mm)、2 つのスペーサー (厚さ 0.17 mm によって提供される分離、サイズ = 10 mm × 24 mm)、図 2に示すように。これらのガラスに特殊なコーティングが必要としないことに注意してください。 手順 4.1 低い対物レンズで作製したサンプルにセルを配置 (ca. 10 μ l、倍率と浸漬を水 60 X、作動距離を = = 0.28 mm、開口数 = 1.2))。 上部の対物レンズを添付 (ca. 10 μ l、倍率と浸漬を水 = 60 X、作動距離 2 mm、開口を = = 1.0) サンプル セルの上部に。 LED ライトを点灯アイコン 2 (図 1b) をクリックします。 パネル 3 (図 1b) のアイコンをクリックして、サンプルと低い対物レンズ間の距離を調整するまで、それが焦点に。 I、II、および III (図 1b) アイコンをクリックして、位置 1 と位置 2 (図 1B) サンプルのレーザー光を照射します。 各レーザー ビームの強度を 1,500 に設定アイコン IV (図 1b) にこの値を入力して mW。 セルまで 4 のアイコンを示す方向 (図 1b) をクリックしてサンプル ステージは位置 1 (図 1b) に閉じ込められて移動します。 ドラッグして、別のセルまでの位置 2 (図 1b) を示すカーソルが 2 位に閉じ込められました。 5、3 次元 (3 D) セル構造の建設 単一のセルを操作して別のセルに接触しています。300 のこの状態を維持 s;すなわち、各セルが 300 のためのレーザーにさらされている s。 図 1bに示すように X と Y 軸を記録します。 トラップし、セルに別のセルを輸送して任意の 2 D セル アセンブリを構築します。 ステージを上下に移動することによって、3 D 携帯電話アセンブリを構築します。 レーザーはオフ後アセンブリが安定していることを確認します。