טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic
Summary
מאמר זה מתאר שיטות ספציפיות כדי לקבל כמויות הביוכימי של solubilized-חומרי ניקוי TRPV1 לניתוח spectroscopic. הפרוטוקולים המשולב לספק כלים הביוכימי biophysical זה ניתן להתאים להקל פונקציונלי מבניים ללימודי תעלות היונים בתרבית של סביבה מבוקרת ממברנה.
Abstract
תעלות יונים Polymodal מגלי גירויים מרובים מפלאי שונים לתוך השינויים allosteric; אלה הייצורים החיים דינמיים הם מאתגרים לקבוע ולהישאר אינו מודע לקיומם. עם ההתקדמות האחרונה יחיד-חלקיקים הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ (הקפאה-EM) שפיכת האור על המאפיינים המבניים של אתרי קישור אגוניסט, מנגנון הפעלה של מספר תעלות יונים, הבמה מוכנה לניתוח מעמיק דינמי של gating שלהם מנגנונים שימוש בגישות ספקטרוסקופיות. שיטות ספקטרוסקופיות אלקטרונים פאראמגנטיים תהודה (EPR) ו אלקטרון כפול-אלקטרון תהודה (צבי) היה מוגבל בעיקר במחקר של תעלות יונים prokaryotic זה יכול להיטהר בכמויות גדולות. הדרישה עבור כמויות גדולות של חלבונים פונקציונליים ויציב ממברנה יש הקשו המחקר של תעלות יונים יונקים באמצעות הגישות האלה. EPR וצבאים מציעים יתרונות רבים, לרבות קביעת המבנה ושינויים דינמי של חלבון ניידים אזורים, אמנם ברזולוציה נמוכה, שעשויה להיות קשה להשיג על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או הקפאה-EM, וניטור gating הפיך מעבר (קרי, סגור, פתוח, רגיש, רגישות). כאן, אנו מספקים פרוטוקולים להשגת מיליגרם של קולטן ארעי solubilized דטרגנט פונקציונלי פוטנציאליים הקטיון ערוץ תת V חבר 1 (TRPV1) יכול להיקרא על ספקטרוסקופיה EPR וצבאים.
Introduction
עם ההתקדמות יחיד-חלקיקים הקפאה-מיקרוסקופ (הקפאה-EM), יון בתרבית של ערוץ מבנים הושגו בקצב יוצא דופן. במיוחד, מחקרים מבנית של תעלות יונים polymodal, כגון vanilloid פוטנציאלי קולטן ארעי 1 (TRPV1), סיפקו יותר הבנה של הפעלת מנגנונים1,2,3, 4 , 5. עם זאת, נדרש מידע דינמי על יון ערוצי מוטבע בסביבת ממברנה כדי להבין את מנגנוני חסימה ואיגוד התרופות שלהם polymodal.
אלקטרון פאראמגנטיים תהודה (EPR) ואת אלקטרון כפול-אלקטרון תהודה (צבי) spectroscopies סיפקו כמה דגמים מכניסטית סופית ביותר עבור יון ערוצי6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. גישות אלה היה מוגבל בעיקר הבחינה של prokaryotic ו archeal יון ערוצי זה להניב כמות גדולה של חלבונים מטוהרים דטרגנט כאשר overexpressed בחיידקים. עם התפתחות ממברנות האיקריוטים ייצור חלבונים חרק, בתרבית של תאים עבור אפיון פונקציונלי ומבניים14,15,16, עכשיו זה אפשרי להשיג הביוכימי כמויות של חלבונים מטוהרים דטרגנט ללימודי ספקטרוסקופיות.
האותות EPR וצבאים נובעים תווית paramagneticspin (SL) (קרי, methanethiosulfonate) קשורה משקע יחיד-ציסטאין בחלבון. הספין-התוויות דווח על שלושה סוגים של נתוני מבנה: תנועה, accessibilities, מרחקים. מידע זה מאפשר לקבוע אם שאריות קבורים בתוך החלבון או חשופים ממברנה או סביבה מימית אפו ואת הברית ליגנד מכורך13,17,18,19. בהקשר של מבנה ברזולוציה גבוהה (אם זמין), הנתונים EPR וצבאים לספק אוסף של אילוצים שיניעו מודלים דינאמיים בסביבה הטבעית שלהם תוך מעקב אחר המעבר חסימה הפיכה (קרי, סגור, פתוח, רגיש, רגישות). יתר על כן, האזורים גמישה שעשויה להיות קשה לקבוע על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או הקפאה-EM יכולה להיות מושגת באמצעות ערכות נתונים סביבתיים אלה כדי להקצות מבנים משניים, כמו גם מיקום בתוך חלבון20. הקפאה-EM מבנים בשנת השומנים nanodiscs סיפק מידע חיוני על דרך השער של יון ערוצי3,21,22,23,24, 25; עם זאת, גישות ספקטרוסקופיות יכול לספק מידע דינאמי ממדינות הסתגלותי (למשל, שינויים תרמיים) זה יכול להיות קשה לקבוע באמצעות הקפאה-EM.
קשיים רבים להכריעו ליישם EPR וצבאים, כולל חוסר וחלבון לתפקד בעת הסרת כל שאריות ציסטאין (במיוחד בשפע ערוצי יונקים), התשואה חלבון נמוך, חלבון יציבות במהלך טיהור ואחרי ספין תיוג , ואת החלבון צבירת חומרי ניקוי או ליפוזומים. . הנה, עיצבנו פרוטוקולים כדי להתגבר על מחסומים אלה קריטיות והשגת צבי ומידע ספקטרה EPR עבור יונקים קולטן חישה. המטרה כאן היא לתאר את מתודולוגיות כי הביטוי טיהור, תיוג, שיחזור של חולדה ציסטאין-פחות מינימלי ופונקציונלי TRPV1 (eTRPV1) לבנות עבור ניתוחים spectroscopic. מתודולוגיה זו מתאימה עבור אלה חלבונים קרום זה לשמור על תפקידם למרות הסרת שאריות ציסטאין או שמכילות ציסטאין ויוצרים דיסולפידי-חוב. זה אוסף של פרוטוקולים יכול להתאים לניתוח spectroscopic של תעלות יונים יונקים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכנולוגיות הנוכחי עבור ביטוי וטיהור של חלבוני ממברנה יונקים הפכו אותה ניתן לקבל כמויות מספיקות של חלבון עבור מחקרים ספקטרוסקופיות14,15,16,42. כאן, אנחנו הסתגלו טכנולוגיות אלה כדי לבטא, לטהר, לשקם, לבצע ניתוח spectroscopic ב TRPV1.
…Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מאוד ד ר Mchaourab ה על מתן גישה ספקטרומטרים EPR וצבאים, ד ר רוזנבאום ט עבור מספקים את פלסמיד TRPV1 ציסטאין-פחות באורך מלא.
Materials
| QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 210519-5 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fisher Scientific | A416 | |
| Albumin Bovine Serum (BSA) | GoldBio.com | A-420-10 | |
| Amylose resin | NEB | E8021L | |
| Aprotinin | GoldBio.com | A-655-25 | |
| Asolectin from Soybean | Sigma | 11145 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen Life Technologies | 10359016 | |
| Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 | |
| Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) | Drummond Scientific | 3-000-203 G/X | |
| Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) | Sutter Instrument | B150-110-10HP | |
| CaCl2 2H2O | Fisher Scientific | C79 | |
| Carbenicillin (Disodium) | GoldBio.com | C-103-5 | |
| Cellfectin Reagent | Invitrogen Life Technologies | 10362-010 | |
| cellSens | Olympus | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606SK | |
| Collagenase Type 1 | Worthington-Biochem | LS004196 | |
| Critiseal | VWR | 18000-299 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| D-(+)-Maltose Monohydrate | Fisher Scientific | BP684 | |
| DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
| High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Sigma | D0572 | |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 45-000-148 | |
| EGTA | Fisher Scientific | O2783 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F-14201 | |
| GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Science, Inc | 2160250 | |
| GenCatch PCR Cleanup Kit | Epoch Life Science, Inc | 2360050 | |
| Gentamicin Sulfate | Lonza | 17-518Z | |
| Glass capillary (25 µl) | VWR | 53432-761 | |
| Glass Flask 2800 mL | Pyrex USA | 4423-2XL | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229 | |
| HEK293S GnTl- | ATCC | CRL-3022 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) | GoldBio.com | I2481C25 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| KCl | Fisher Chemical | P217 | |
| LB Broth, Miller | Fisher bioReagents | BP1426 | |
| Leupeptin Hemisulfate | GoldBio.com | L-010-5 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Life Technologies | 11668-019 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | BP214 | |
| MgSO4 7H2O | Fisher Scientific | BP213 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Ambion | AM1344 | |
| MOPS | Fisher bioReagents | BP2936 | |
| MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate | Toronto Research Chemicals, Inc | O873900 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-062 | |
| Pepstatin A | GoldBio.com | P-020-5 | |
| Pluronic Acid F-127 (20%) | PromoKine | CA707-59004 | |
| PMSF | GoldBio.com | P4170 | |
| Poly-L-lysine Solution | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Sealed capillary | VitroCom | special order | |
| SF-900 II SFM (insect cell medium) | Gibco, Life Technologies | 10902-088 | |
| Sf9 Cells (SFM Adapted) | Invitrogen Life Technologies | 11496-015 | |
| Soybean Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids, Inc | 541602C | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590 | |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 29091596 | |
| TCEP HCl | GoldBio.com | TCEP1 | |
| Tetracyclin Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Tris Base | Fisher BioReagents | BP152 | |
| Tryptone | Difco | 0123-01 | |
| X-gal | GoldBio.com | X4281C | |
| Xenopus oocytes | Nasco | LM00935M | |
| XL1 – Blue Competent Cells | Agilent Technologies, Inc | 200249 | |
| Yeast Extract | Difco | 0127-01-7 | |
| Econo-Pack chromatography column | Bio-Rad | 7321010 | |
| Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels | Bio-Rad | 17000436 | |
| pFastBac1 Expression Vector | Invitrogen Life Technologies | 10360-014 | |
| DH10Bac Competent Cells | Invitrogen Life Technologies | 10361-012 | |
| Critiseal capillary tube sealant | Leica Microsystems | 02-676-20 | |
| ABI Model 3130XL Genetic Analyzers | Applied Biosystems | 4359571 | |
| Transfer pipete | Fishebrand | 13-711-9AM | |
| Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 |
Referenzen
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
- Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
- Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
- Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
- Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
- Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
- Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
- Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
- Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
- Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
- Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
- Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
- Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
- Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
- Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
- McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemie. 35, 7692-7704 (1996).
- Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochemie. 40, 3828-3846 (2001).
- Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
- Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
- Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
- Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
- Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
- McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
- Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L., Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
- Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861 (2017).
- Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
- Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
- Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
- Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
- Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
- Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040 (2013).
- Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
- Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
- Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740 (2014).
- Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
- Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
- Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
- Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
- Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
- He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
- Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochemie. 48, 5782-5784 (2009).
