Definerte Xeno-fri og mater-fri kultur betingelser for generering av menneskelig iPSC-avledet Retinal celle modeller
Summary
Produksjon av spesialiserte netthinnen celler fra pluripotent stamceller er et vendepunkt i utviklingen av stilk cellen-basert behandling for retinal sykdommer. Dagens papir beskriver en enkel metode for en effektiv generasjon av netthinnen organoids og retinal pigmentert epitel for grunnleggende translasjonsforskning og klinisk forskning.
Abstract
Produksjon av spesialiserte celler fra pluripotent stamceller gir et kraftig verktøy for å utvikle nye metoder for regenerativ medisin. Bruk av menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs) er spesielt attraktivt for nevrodegenerative sykdommer studier, inkludert retinal dystrophies, der iPSC-avledet retinal celle modeller merke et stort skritt fremover å forstå og kjempe blindhet. I dette papir beskriver vi en enkelt og skalerbar protokoll for å generere modne og cryopreserve retinal organoids. Basert på medium endre, den største fordelen med denne metoden er å unngå flere tidkrevende trinn kreves vanligvis en guidet atskilling av iPSCs. Etterligne de tidlige fasene av netthinnen utvikling av etterfølgende endringer av definert medier på tilhenger menneskelige iPSC kulturer, denne protokollen tillater samtidig generering av selv danner neuroretinal strukturer og retinal pigmentert (RPE) epitelceller i en reproduserbar og effektiv måte i 4 uker. Disse strukturene som inneholder retinal progenitor celler (RPCer) kan være enkelt isolert for ytterligere modning i flytende kultur stand aktivere differensiering av RPCer inn i sju retinal celletyper tilstede i voksen human netthinnen. I tillegg beskriver vi raske metoder til kryonisk bevaring av netthinnen organoids og RPE celler for langtidslagring. Kombinert sammen, vil metodene som er beskrevet her være nyttig å produsere og bank menneskelige iPSC-avledet netthinnen celler eller vev for både grunnleggende og klinisk forskning.
Introduction
Netthinnen er en integrert del av sentralnervesystemet (CNS) og har begrenset kapasitet til å regenerere spontant etter en traumatisk skade eller sykdommer. Derfor føre degenerative patologi som forårsaker definitive retinal celle tap, som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), retinitis pigmentosa (RP), grønn stær og diabetisk retinopati, vanligvis til irreversible blindhet. Redde degenerert netthinnen er en stor utfordring som stilk cellen-basert behandling å erstatte skadet eller tapt cellene er en av de mest lovende tilnærminger1,2,3. Pluripotent stamceller som menneskelige embryonale stamceller (ESCs) celler eller menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs) har kapasitet til å bli utvidet på ubestemt tid i kultur, og de har muligheten å tilvirke alle celletyper. Fremskritt innen vår forståelse av netthinnen utvikling og forbedring av in vitro protokoller for menneskelig iPSC differensiering har resultert i generasjon av netthinnen organoids7,8,9, 10,11,12. Alle store retinal cellene, inkludert retinal ganglieceller (RGCs), fotoreseptorer og retinal pigmentert (RPE) epitelceller, har blitt vellykket differensiert fra menneskelige ESCs og iPSCs4,5, 6. basert på SFEB (serum-fri kultur av embryoid kroppen som aggregater) metoden utviklet av Eiraku et al. 13, selv dannelsen av netthinnen organoids kan fås fra ESC – eller iPSC-avledet embryoid kroppen som aggregater i definerte ekstracellulær matrix komponenter7,10,14. Men disse protokollene er intrikate, som krever mange trinn ikke alltid kompatibel med store produksjonen av celler for terapeutiske metoder eller narkotikarelaterte screening. Dermed valget av metoden å produsere human netthinnen celler er kritisk og metoden må være robuste, skalerbare og effektive.
Her beskriver vi basert på vår forrige publikasjonen15, hvert trinn for en enkel og effektiv generasjon netthinnen celler gjennom netthinnens organoid selv formasjon fra tilhenger menneskelige iPSCs dyrket i en mater- og xeno-fri tilstand. Denne protokollen fra rutinemessige kulturer av tilhenger menneskelige iPSCs, og krever bare en enkel påfølgende medium endrer tillate generering av både iPS-avledet RPE (hiRPE) celler og neuroretinal strukturer i 4 uker. Etter en manuell isolasjon, hiRPE kan utvides og retinal strukturer kan kultivert som flytende organoids hvor retinal progenitor celler er kjøpedyktig skille ut alle retinal celletyper i en rekkefølge som er forenlig med den i vivo menneskelige retinogenesis. Til slutt, forskning utvikling eller klinisk oversettelse beskriver vi en kryonisk bevaring metoden tillater lagring av hele retinal organoids og hiRPE celler uten å påvirke deres fenotypiske egenskaper og funksjonaliteten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver hvordan RPE celler og retinal organoids, som inneholder retinal RGCs og fotoreseptorer, fra menneskelige pluripotent stamceller i xeno- og mater-fri forhold. Kompatibel med god produksjon praksis (GMP) prosessen metoden dyrket presenteres her gjør en stor produksjon av iPSC-avledet netthinnen celler som RPE celler, RGCs og fotoreseptorer for utvikling av stilk cellen-basert behandling og stoff Discovery tilnærminger for fremtidige behandling av netthinnens degenerative sykdommer. Kryonisk be…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke medlemmer av Goureau’s team for innspill deres under Oppsett av metodene som er beskrevet her, og G. Gagliardi og M. Garita for deres kritisk lesing. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), netthinnen Frankrike foreningen og den teknologioverføring selskapet SATT Lutech. Det ble også utført i rammen av LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) støttes av ANR Investissements d’Avenir programmet (ANR-11-IDEX-0004-02).
Materials
| Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
| CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
| Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
| Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
| CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
| N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
| CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
| CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
| Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
| AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
| Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
| 24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
| 6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |
Referenzen
- Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
- Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -. A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
- Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
- Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).
- Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
- Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
- Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
- Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
- Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
- Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
- Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
- Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).
