Tranches de cerveau-hypophyse saines pour les études électrophysiologiques des cellules hypophysaires chez les poissons téléostéens

L’hypophyse est un organe clef endocrine chez les vertébrés situés au-dessous de l’hypothalamus et derrière le chiasma optique. Il produit et sécrète des hormones de six à huit des types spécifiques de cellules. Hormones hypophysaires constituent un intermédiaire entre le cerveau et les organes périphériques et conduire un large éventail de processus physiologiques essentiels dont la croissance, la reproduction et la régulation de l’homéostasie. Similaire aux neurones, les cellules endocrines de l’hypophyse sont électriquement excitables avec la possibilité de tirer des potentiels d’action spontanément ¹. Le rôle de ces potentiels d’action est la cellule dépendante. Dans plusieurs types de cellules de l’hypophyse chez les mammifères, les potentiels d’action peuvent élever l’intracellulaire Ca^{2 +} suffisamment pour une libération prolongée de l’hormone ². En outre, l’hypophyse reçoit des informations de stimulateurs et inhibiteurs du cerveau qui affecte le potentiel de membrane des cellules ^3,4,5,6. En règle générale, entrée stimulatrice augmente l’excitabilité et souvent implique la libération de Ca^{2 +} des réserves intracellulaires ainsi augmenté tir fréquence ⁷. Comprendre comment la cellule utilise la composition de canal d’ion et s’adapte à ces signaux du cerveau est la clé de la synthèse des hormones compréhension et libération.

La technique du patch-clamp a été développée dans les années 1970 par Sakmann et Neher ^8,9,10 et encore améliorée par Hamill ¹¹et permet des enquêtes détaillées sur les propriétés électrophysiologiques des cellules vers le bas pour les canaux ioniques isolés. Par ailleurs, la technique peut être utilisée pour l’étude de courant et tension. Aujourd’hui, serrage patch est l’étalon-or pour mesurer les propriétés électrophysiologiques de la cellule. Quatre principales configurations de la technique de patch clamp d’étanchéité ont été développés ¹¹; la cellule-attachée, la dedans-dehors, l’extérieur-out et le patch de cellules entières. Les trois premières configurations sont généralement utilisées pour les enquêtes de canal ionique unique. Pour la quatrième, suivant la configuration cellule-attachée, un trou dans la membrane cellulaire est réalisée à pression atmosphérique Sub. Cette configuration permet également aux enquêtes de la composition de canal ionique de la cellule entière ¹². Cependant, une des limites de cette technique sont que les molécules cytoplasmiques sont dilués par le patch pipette solution ¹³ (Figure 1A), ce qui influe sur les réponses électriques et physiologiques des cellules étudiées. En effet, certaines de ces molécules peuvent jouer un rôle important dans la transduction du signal ou la régulation des canaux ioniques différentes. Pour éviter cela, Lindau et Fernandez ¹⁴ a développé une méthode où un composé formant des pores est ajouté à la pipette. Après la configuration de la cellule-attachée, le composé sera intégrer dans la membrane plasmique sous le timbre et lentement perforer la membrane créant un contact électrique avec le cytosol (Figure 1B). Plusieurs différents antifongiques comme nystatine ¹⁵ et amphotéricine B ¹⁶, ou les agents tensio-actifs comme la saponine bêta-escine ^17,18 peuvent être utilisé. Ces composés créer pores assez grands pour permettre des cations monovalents et Cl^– diffusion entre le cytosol et la pipette tout en préservant les niveaux cytosoliques des macromolécules et des ions plues comme Ca^{2 + 15, 16}.

Le défi de l’utilisation de patch perforé est la résistance série potentiellement élevés. Résistance série (R,_s) ou accès résistance dépasse la résistance combinée la pipette relativement au sol. Pendant les enregistrements de patch-clamp, le R_s sera en parallèle avec la résistance de la membrane (R_m). R_m et R_s dans un travail parallèle comme un diviseur de tension. Avec la haute R_s, la tension risque de tomber le R de_s des erreurs dans les enregistrements. L’erreur deviendra plus grande avec les plus grands courants enregistrés. En outre, le diviseur de tension est aussi fréquence dépendant de création d’un filtre passe-bas, affectant ainsi la résolution temporelle. En effet, le patch perforé ne permette pas toujours les enregistrements d’un grand et rapide comme le voltage dépendants des courants Na⁺ (pour les lectures détaillées voir référence ¹⁹). En outre, R_s peuvent varier pendant les enregistrements de patch clamp, encore une fois, conduisant à des changements dans le courant enregistré. Ainsi, les faux positifs peuvent se produire dans les situations où R_s change pendant la demande de drogue.

L’électrophysiologie sur le tissu en tranches a été introduite par le laboratoire d’Andersen à l’étude des caractéristiques électrophysiologiques des neurones dans le cerveau de ²⁰. La technique a ouvert la voie à des investigations détaillées des cellules isolées, mais aussi des circuits de communications et de la cellule de cellules dans un environnement plus intact. Une technique similaire pour faire des tranches hypophysaires a été introduite en 1998 par Guérineau et al. ²¹. Toutefois, il n’était pas avant 2005, cette préparation de tranches de cerveau-hypophysaire a été utilisée avec succès pour les études de patch clamp en téléostéens ²². Dans cette étude, les auteurs signalent également l’utilisation d’enregistrements perforés patch clamp. Toutefois, de loin, la plupart des études électrophysiologiques des cellules hypophysaires ont été réalisée chez les mammifères et seule une poignée d’autres vertébrés, y compris les poissons téléostéens ^1,2,22,23 . Chez les téléostéens, presque toutes les études ont été réalisées sur des cellules dissociées primaire ^{24,25,26,27,28,29,30} .

Dans le présent document, nous décrivons un protocole optimisé pour la préparation des tranches de cerveau-hypophysaire sains du médaka poisson de modèle. L’approche représente plusieurs avantages par rapport aux cultures primaires de cellules dissociées. Tout d’abord, les cellules sont enregistrées dans un environnement relativement préservé par rapport à dissocié des conditions de culture cellulaire. Deuxièmement, préparations de tranches nous permettent d’étudier les voies indirectes médiées par les cellules de communication ²², qui n’est pas possible dans les conditions de culture de cellules dissociées. En outre, nous montrent comment effectuer des enregistrements électrophysiologiques sur les tranches de tissus obtenus à l’aide de la technique de patch-clamp de la cellule entière perforé avec l’amphotéricine B comme agent formant des pores.

Médaka est un petit poisson d’eau douce originaire d’Asie, présent principalement au Japon. La physiologie, embryologie et la génétique des médakas ont été largement étudiée pour plus de 100 ans ³¹, et c’est un modèle de recherche communément utilisé dans de nombreux laboratoires. Une importance particulière à ce document est l’organisation morphologique distincte du complexe hypothalamus-pituitaire chez les poissons téléostéens : alors que chez les mammifères et les oiseaux, les neurones hypothalamiques libèrent leurs neuro-hormones régulation hypophysaires cellules endocrines dans le système de la porte de l’éminence médiane, il y a une projection nerveuse directe des neurones hypothalamiques sur les cellules endocrines de l’hypophyse de poissons téléostéens ³². Ainsi, soigneusement conduite cerveau-hypophysaire trancher, c’est d’une importance particulière chez les poissons, nous permettant d’étudier les caractéristiques électrophysiologiques des cellules hypophysaires dans un réseau de cerveau-hypophysaire bien préservé et des cellules en particulier comment hypophysaires contrôler leur excitabilité et, partant, l’homéostasie de Ca^{2 +} .