Gezonde hersenen-hypofyse segmenten voor elektrofysiologische onderzoek van hypofyse cellen in Teleost vis

De hypofyse is een belangrijke endocriene orgaan in gewervelden gelegen onder de hypothalamus en posterieure aan de optiek opticum. Het produceert en scheidt van zes tot acht hormonen uit de specifieke celtypen. Hypofyse hormonen vormen een intermediair tussen de hersenen en perifere organen en rijden een breed scala van essentiële fysiologische processen, met inbegrip van de groei, de voortplanting, en de verordening van homeostase. Vergelijkbaar met neuronen, endocriene cellen van de hypofyse zijn elektrisch prikkelbaar met de mogelijkheid om de actie potentieel spontaan brand ¹. De rol van het potentieel van deze actie is cel afhankelijk. In verschillende celtypen van de zoogdieren hypofyse, kan actie potentieel verheffen de intracellulaire Ca^{2 +} voldoende voor een duurzame release van hormoon ². Daarnaast ontvangt de hypofyse zowel stimulerende en inhiberende informatie van de hersenen dat invloed op de membraanpotentiaal van de cellen ^3,4,5,6. Meestal stimulerend input verhoogt de prikkelbaarheid en vaak gaat om de vrijlating van Ca^{2 +} van intracellulaire winkels evenals toegenomen frequentie ⁷afvuren. Begrijpen hoe de cel maakt gebruik van de ion kanaal samenstelling en past zich aan deze input signalen van de hersenen is de sleutel tot begrip hormoon synthese en release.

De patch-clamp techniek werd ontwikkeld in de late jaren 1970 door Sakmann en Neher ^8,9,10 en verder verbeterd door Hamill ¹¹, en maakt het mogelijk gedetailleerd onderzoek van elektrofysiologische eigenschappen van cellen tot één ionenkanalen. Bovendien, de techniek kan worden gebruikt voor de bestudering van zowel de huidige als de spanning. Vandaag, is patch-klemmen de gouden standaard voor het meten van elektrofysiologische eigenschappen van de cel. Vier grote configuraties van de goede afdichting patch-clamp techniek geweest ontwikkelde ¹¹; de cel-ingeschrevenen, de binnenstebuiten, de buiten-out en de patch geheel-cel. De drie eerste configuraties worden doorgaans gebruikt voor één ion kanaal onderzoeken. Voor het vierde, volgens de configuratie van cel-ingeschreven, is een gat in de celmembraan gemaakt met behulp van sub atmosferische druk. Deze configuratie kan ook onderzoeken van de ion kanaal samenstelling van de gehele cel ¹². Een beperking van deze techniek is echter dat de cytoplasmatische moleculen door de patch Pipetteer oplossing ¹³ (Figuur 1A), dus op het gebied van de elektrische en fysiologische reacties van de bestudeerde cellen worden verdund. Sommige van deze moleculen kunnen inderdaad, een belangrijke rol spelen in de transductie van het signaal of in de regulatie van verschillende ionenkanalen. Om dit te vermijden, ontwikkelde Lindau en Fernandez ¹⁴ een methode waar een porie-vormende compound is toegevoegd aan de patch pipet. Na de configuratie van de cel-ingeschrevenen zal de compound integreren in het plasma-membraan onder de patch en langzaam perforate het membraan elektrisch contact maken met het cytosol (Figuur 1B). Verscheidene verschillende antischimmelmiddelen zoals nystatine ¹⁵ en amfotericine B ¹⁶, of oppervlakteactieve stoffen zoals de saponine bèta-escin ^17,18 , kunnen worden gebruikt. Deze verbindingen maken poriën groot genoeg is om te laten monovalent kation en Cl^– verspreiding tussen het cytosol en de patch pipet met behoud van de cytosolische niveaus van macromoleculen en grotere ionen zoals Ca^{2 + 15, 16}.

De uitdaging van het gebruik van geperforeerde patch is de weerstand van de potentieel hoge serie. Serie weerstand (R_s) of toegang weerstand is de gecombineerde weerstand over de patch pipet ten opzichte van de grond. Tijdens de opnames van de patch-clamp, zullen de R_s parallel met membraan weerstand (R_m). R_m en R,_s in parallelle werk als een divider spanning. Met de hoge R_s, zakt de spanning over de R_s geven fouten in de opnames. De fout zal worden groter met grotere stromen opgenomen. Daarnaast is de spanning divider ook frequentie afhankelijk maken van een low-pass filter, dus op het gebied van de temporele resolutie. In feite kan de geperforeerde patch niet altijd toestaan opnames van grote en snelle stromingen zoals de spanning gated nb⁺ stromingen (voor gedetailleerde lezingen Zie referentie ¹⁹). R_s kan ook variëren tijdens opnames in patch-clamp, opnieuw leiden tot veranderingen in de opgenomen stroom. Valse positieven kunnen dus optreden in situaties waar R_s tijdens de toepassing van de drug verandert.

De electrofysiologie over de gesneden weefsel is geïntroduceerd door het Andersen-lab te bestuderen elektrofysiologische kenmerken van de neuronen in de hersenen- ²⁰. De techniek geëffend voor gedetailleerde onderzoeken van afzonderlijke cellen, alsmede cel-cel communicatie en cel circuits in een omgeving met meer intact. Een soortgelijke techniek voor het maken van de hypofyse segmenten werd in 1998 geïntroduceerd door Guérineau et al. ²¹. het was echter niet vóór 2005, dat de bereiding van hersenen-hypofyse segment was met succes gebruikt voor patch-clamp studies in teleost ²². In deze studie de auteurs ook gemeld het gebruik van geperforeerde patch-clamp opnames. Echter verreweg hebben de meeste van de elektrofysiologische onderzoeken van hypofyse cellen plaatsgevonden in zoogdieren, en slechts een handvol andere gewervelde dieren, met inbegrip van teleost vis ^1,2,22,23 . In teleosts, werden bijna alle studies uitgevoerd op primaire gedissocieerde cellen ^{24,25,26,27,28,29,30} .

In het huidige document, duidelijk naar voren komt een geoptimaliseerde protocol voor de voorbereiding van de gezonde hersenen-hypofyse segmenten van het model vis medaka. De aanpak vertegenwoordigt verschillende voordelen ten opzichte van primaire gedissocieerde celculturen. Ten eerste, de cellen worden opgenomen in een relatief bewaarde omgeving ten opzichte van cel kweekomstandigheden losgekoppeld. Ten tweede laten segment preparaten te bestuderen van indirecte trajecten gemedieerd door cel-cel communicatie ²², die is niet mogelijk in de kweekomstandigheden gedissocieerde cel. Bovendien laten we zien hoe te voeren elektrofysiologische opnames op het verkregen weefsel segmenten met behulp van de geperforeerde geheel-cel patch-clamp techniek met amfotericine B als de porie-vormende agent.

Medaka is een kleine zoetwatervis Azië, voornamelijk gevonden in Japan. De fysiologie, embryologie en genetica van medaka zijn uitvoerig bestudeerd voor meer dan 100 jaar ³¹, en het is een veelgebruikte onderzoeksmodel in veel laboratoria. Voor dit papier van bijzonder belang is de verschillende morfologische organisatie van de hypothalamus-hypofyse-complex in teleost vis: Overwegende dat in zoogdieren en vogels vrij de hypothalamische neuronen hun neuro-hormonen reguleren van hypofyse endocriene cellen in de portal system van de mediane eminentie is er een directe nerveus projectie van hypothalame neuronen op de endocriene cellen van de hypofyse in teleost vis ³². Dus is zorgvuldig uitgevoerde hersenen-hypofyse snijden van bijzonder belang in vis, waardoor wij onderzoeken elektrofysiologische kenmerken van de hypofyse cellen in een goed bewaarde hersenen-hypofyse-netwerk, en met name hoe hypofyse cellen controle van hun prikkelbaarheid en daarmee Ca^{2 +} homeostase.