大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法
Summary
大人の皮膚組織からプライマリ ヒト角を効率的に分離するためのプロトコルをご紹介します。このメソッドは、自発的に皮膚細胞から表皮細胞を分離する接種培地で岩阻害剤の Y-27632 を使用して従来の手順を簡素化します。
Abstract
新鮮な皮膚組織とその拡大培養から分離されたプライマリ ヒト角は実験室の研究および臨床応用、広く使用されています。ヒト角化従来の分離方法は、低細胞回収率、減らされた細胞による成体組織から細胞を生成する効率的に証明されている 2 つの連続酵素消化手順生存率。我々 は最近、媒体の Rho キナーゼ阻害剤 Y-27632 を活用した皮膚組織中の人間の主な表皮の前駆細胞を分離する高度な方法を報告しました。従来のプロトコルと比較して、この新しいメソッドは、単純な簡単に、そして少ない時間のかかる、上皮幹細胞収量が増加し、その幹細胞の特性が向上します。さらに、新しい方法論は真皮から表皮の分離を必要としないし、したがって、異なったタイプの大人のティッシュからの細胞を隔離するために適しています。この新規分離培養手法は従来の方法の主な欠点を克服、高能室と臨床応用の両方表皮細胞の大量生産に適しています。ここでは、詳細に新しい手法について述べる。
Introduction
目標は、臨床応用の特に成体からプライマリ人間ケラチノ サイト (HKCs) を分離する簡単で効率的なプロトコルを開発することでした。皮膚表皮幹細胞、皮膚の基底層に局在を持って増殖し区別するため、皮膚1,2,3,の機能を維持するケラチノ サイトを提供する可能性の高い4. HKCs 組織は皮膚組織工学と再生のために特に痛んだ肌の修復と遺伝子治療臨床応用5,6広く皮膚から分離しました。HKC ベースのアプリケーションにとって重要な問題は、効率的に分離し、高い潜在的な体外7,8で HKCs の大きな数字を展開することです。これらのメソッドは時々 時間がかかり、実行および低細胞収率と皮膚標本の種類によって限定されているなど、その他の制限に関して複雑なさまざまな研究グループは、幹のような HKCs の文化を生産する方法を開発しているが、9を使用します。例えば、皮膚組織中の HKCs を分離する従来の方法は、6真皮から表皮の分離と 2 段階の酵素消化を含まれます。そのメソッドは通常新生児の組織のためによく働くが、成体組織から細胞を分離するために使用するとき非常に困難します。
Y-27632、Rho 関連キナーゼ (ロック) の阻害剤は、表皮幹細胞の分離と植民地成長10、11,12の効率を大きく向上する報告されています。以前の研究では、我々 は Y-27632 は表皮細胞のクローナルな増殖が容易になりますが、特異的接着分子13式を制御することによって皮膚細胞の収量が減少を発見しました。また、G の中、成長と一次表皮細胞の収量をサポートすると呼ばれる新しいエアコン接種媒体を確立しました。Y-27632 を G の中を組み合わせることによりこの手法自発的に表皮真皮分離13,14のステップを除去する酵素の消化力の後表皮及び真皮細胞を区切ることができます。大人の皮膚組織から HKCs を分離するこの新しい方法の詳細な手順を述べる今以前の報告に基づき、.
Protocol
Representative Results
Discussion
培養主 HKCs は、3 年以上の診療所で傷を治療するために広く利用されているし、その時間以来常にタイムリーで効率的に臨床応用のための細胞の十分な数を取得することが重要です。したがって、実習では、真皮から表皮の分離を必要とする従来の分離法が難しく細胞と成体細胞を通過する低能力の低収量のためのこれらの要求を満たすために。ここでは、効率的に研究室と臨床応用の両方?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、キー研究と開発中国プログラム (2017YFA0104604)、国家自然科学基金の中国 (NSFC、81772093)、一般的なプログラムによって支持された科学および技術開発プログラムの蘇 (ZXL2015128)江蘇省 (BK20161241) の自然科学財団と山東省泰山学者賞 (tshw201502065)。
Materials
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
Referenzen
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383 (2012).
- Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells – role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
- Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
- Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
- Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
- Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).
