أسلوب مبسط وفعال لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لكفاءة عزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار. يبسط هذا الأسلوب الإجراء التقليدي باستخدام Y-27632 مثبط لموسيقى الروك في الأجلين المتوسط والتطعيم بصورة عفوية فصل خلايا البشرة من خلايا الجلد.
Abstract
الكيراتينيه البشرية الأولية المعزولة من أنسجة الجلد طازجة وعلى التوسع في المختبر يستخدم على نطاق واسع لمختبر البحوث والتطبيقات السريرية. طريقة العزل التقليدية الكيراتينيه البشرية ينطوي على إجراء خطوتين هضم الأنزيمي متسلسل، التي ثبت أن تكون غير فعالة في توليد الخلايا الأولية من أنسجة البالغين نظراً لمعدل استرداد الخلية منخفضة وانخفاض الخلية البقاء. نحن ذكرت مؤخرا أسلوب متقدمة لعزل الخلايا البشرية السلف البشرة الأولية من أنسجة الجلد التي تستخدم مثبطات كيناز رو Y-27632 في الأجل المتوسط. وبالمقارنة مع البروتوكول التقليدي، هذا الأسلوب الجديد هو أبسط وأسهل وأقل استهلاكاً للوقت، ويزيد الغلة طلائي الخلايا الجذعية ويعزز خصائصها الخلايا الجذعية. وعلاوة على ذلك، المنهجية الجديدة لا تتطلب انفصال البشرة عن الأدمة، وذلك، وهي مناسبة لعزل الخلايا من أنواع مختلفة من الأنسجة الكبار. هذا الأسلوب الجديد في عزلة يتغلب على أوجه القصور الرئيسية في الطرق التقليدية، وهو أكثر ملاءمة لإنتاج إعداد كبيرة من خلايا البشرة بفاعلية عالية للمختبرات والتطبيقات السريرية. وهنا يصف لنا الطريقة الجديدة بالتفصيل.
Introduction
والهدف من ذلك وضع بروتوكول بسيط وفعال لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية (هككس) من أنسجة البالغين، خاصة بالنسبة للتطبيقات السريرية. خلايا جذعية البشرة الجلد، المترجمة في الطبقة القاعدية للجلد، وتمتلك إمكانات كبيرة لتتكاثر والتفريق وتوفير الكيراتينيه للحفاظ على وظائف الجلد1،2،3، 4-هككس المعزولة من الجلد أنسجة تستخدم على نطاق واسع في الأغراض الجلد الأنسجة الهندسة والتجديد، خاصة في إصلاح تلف الجلد والعلاج الجيني للتطبيقات السريرية5،6. هو القضية الرئيسية للتطبيقات المستندة إلى HKC لعزل بكفاءة وتوسيع إعداد كبيرة من هككس مع ارتفاع محتمل في المختبر7،8. على الرغم من أن مختلف مجموعات بحثية تطورت أساليب إنتاج ثقافات هككس الشبيهة الجذعية، هذه الأساليب في بعض الأحيان تستغرق وقتاً طويلاً ومعقداً لأداء والقيود الأخرى، مثل الخلية منخفضة الغلة ويجري محدودة حسب نوع العينة الجلد ويستخدم9. على سبيل المثال، الأسلوب التقليدي لعزل هككس من أنسجة الجلد ينطوي خطوتين هضم الأنزيمي مع انفصال البشرة عن الأدمة6. هذا الأسلوب عادة ما يعمل بشكل جيد الوليدي الأنسجة، ولكن يصبح من الصعب جداً عندما تستخدم لعزل خلايا من أنسجة البالغين.
Y-27632، المانع من البروتينات المرتبطة رو كيناز (روك)، أبلغ أن يعزز كفاءة الخلايا الجذعية البشرة العزلة ومستعمرة النمو10،،من1112. في دراسة سابقة، اكتشفنا أن Y-27632 يسهل نمو خلايا البشرة الاستنساخ ولكن يقلل عائد خلايا الجلد عن طريق خلطات السيطرة على التعبير عن التصاق جزيئات13. كما أنشأنا وسيلة تلقيح مكيفة جديدة، تسمى ز-المتوسطة، التي تدعم النمو والعائد من خلايا البشرة الأولية. من خلال الجمع بين ز-متوسطة مع Y-27632، يمكن فصل هذا الأسلوب رواية عفويا خلايا البشرة والجلد بعد إنزيم الهضم، وبالتالي إزالة الخطوة البشرة-الأدمة الفصل13،14. استناداً إلى التقارير السابقة، ونحن الآن أن تصف الإجراءات المفصلة لهذا الأسلوب الجديد لعزل هككس من أنسجة الجلد الكبار.
Protocol
Representative Results
Discussion
هككس الابتدائي مثقف قد استخدمت على نطاق واسع لعلاج الجروح في مستوصفات لأكثر من ثلاثة عقود، ومنذ ذلك الوقت، أنها كانت دائماً أهمية كفاءة الحصول على إعداد كافية من الخلايا للتطبيقات السريرية في الوقت مناسب. ولذلك، في الممارسة العملية، طريقة العزل التقليدية، الأمر الذي يتطلب انفصال البشرة …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده هذا العمل الوطني للبحوث الرئيسية وتطوير برنامج للصين (2017YFA0104604)، البرنامج العام “مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية” (تشرف، 81772093)، العلم والتكنولوجيا تنمية البرنامج سوتشو (ZXL2015128)، مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة جيانغسو (BK20161241)، وهي جائزة الباحث شاندونغ تايشان (tshw201502065).
Materials
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
Referenzen
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383 (2012).
- Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells – role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
- Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
- Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
- Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
- Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).
