Tinte de FM ciclismo en la sinapsis: comparación de potasio alto despolarización, eléctrico y Channelrhodopsin estimulación

El modelo glutamatérgica y sinapsis maravillosamente caracterizada Drosophila Unión neuromuscular larvaria (NMJ) se ha utilizado para estudiar la formación de sinapsis y función con un vasto espectro de perturbaciones genéticas¹. El terminal de la neurona de motor consiste en múltiples ramas del axón, cada uno con muchos botones sinápticos ampliadas. Estas várices de gran capacidad (hasta 5 μm de diámetro) contienen toda la maquinaria de la neurotransmisión, incluyendo vesículas sináptica glutamatérgica uniforme (SVs; ~ 40 nm de diámetro) en la reserva citosólica y fácilmente liberable piscinas². Estas vesículas atracan en las membrana plasmática presináptica fusión sitio zonas activas (AZs), donde exocitosis interviene en la liberación de neurotransmisores de glutamato para trans-comunicación sináptica. Posteriormente, la Superintendencia se recupera de la membrana del plasma vía reciclaje beso-y-funcione o endocitosis mediada por clatrina (CME) para los ciclos repetidos de exo/endocitosis. La Drosophila NMJ es fácilmente accesible y adecuado para aislar y caracterizar a mutantes de ciclo SV. Utilizando pantallas genéticas adelantados, mutaciones han conducido a la identificación de nuevos genes críticos para la SV ciclo³. Por otra parte, enfoques genéticos inversos a partir de genes ya conocidos han llevado al esclarecimiento de nuevos mecanismos de ciclo SV por la cuidada Descripción de mutante ciclismo fenotipos⁴. La Drosophila NMJ es casi ideal como una preparación experimental sináptica para diseccionar los mecanismos de endocitosis y exocitosis SV mediante métodos que ópticamente vesícula de pista de ciclismo durante la neurotransmisión.

Una gama de marcadores fluorescentes permiten seguimiento visual de las vesículas durante el ciclo de la dinámica, pero el más versátil es análogos de tinte de la FM que primero es sintetizado por Mao, f el., et al. ⁵. estructuralmente, FM tintes contienen una cabeza hidrofílica y una cola lipofílica conectados a través de un anillo aromático, con una región central que confieren propiedades espectrales. Estos styryl tintes reversible de la partición en las membranas, no ‘flip-flop’ entre los folíolos de la membrana y así nunca son libres en el citosol y son mucho más fluorescentes en las membranas de agua⁵. Inserción reversible en una bicapa de lípidos provoca un 40-fold aumento en fluorescencia⁶. En las sinapsis neuronales, clásica FM tinte etiquetado los experimentos consisten en bañar la preparación sináptica con el tinte durante la despolarización estimulación cargar tinte mediante endocitosis SV. Tinte externo luego es lavado y el ciclo SV es detenido en una solución de ringer sin calcio a la imagen cargada sinapsis⁷. Una segunda ronda de estímulo en un baño de tinte provoca liberación de FM a través de exocitosis, un proceso que puede seguirse midiendo la disminución de la intensidad de fluorescencia. Poblaciones de SV de una sola vesícula a piletas que contienen cientos de vesículas pueden ser monitoreada cuantitativamente^6,7. Tintes de FM se han utilizado para disecar movilización dependiente de actividad de piscinas SV funcionalmente distintas y comparar kiss y gestión vs CME ciclismo^8,9. El método ha sido modificado por separado ensayo evocado, ciclo sináptica espontánea y miniatura actividades (con equipo altamente sensible para detectar cambios de fluorescencia muy pequeña y reducir el fotoblanqueo)¹⁰. Análisis pueden ampliarse a nivel ultraestructural por photoconverting la señal de FM fluorescente en una etiqueta de electrón-densos para transmisión microscopia electrónica^11,12,13,14 .

Históricamente, preparaciones sináptica bañarse en una alta concentración de potasio (en lo sucesivo denominado “alto [K⁺]”) ha sido el método de elección para despolarización estimulación para inducir SV ciclismo; desde la rana colinérgicos NMJ⁵, cultivadas roedores cerebro neuronas hippocampal¹⁵, a la Drosophila glutamatérgica NMJ modelo^16,17. Este enfoque [K⁺] alta es simple, no requiere ningún equipo especializado y por lo tanto es accesible a la mayoría de los laboratorios, pero tiene limitaciones de aplicación y la interpretación de los datos. Un método mucho más fisiológico apropiado es utilizar electrodo de succión estimulación eléctrica del nervio^4,5,12. Este enfoque conduce a potencial de acción propagación para la estimulación directa del nervio presináptico terminal y resultados pueden ser directamente comparados con los ensayos electrofisiológicos de neurotransmisión función^{13,14, 15}, pero requiere equipo especializado y es técnicamente mucho más difícil. Con el advenimiento de optogenetics, el uso de la estimulación neuronal channelrhodopsin tiene ventajas adicionales, incluyendo el estricto control spatiotemporal de la expresión del canal utilizando el binario de sistema de Gal4/UAS²⁰. Este enfoque es técnicamente mucho más fácil que el estímulo de succión del electrodo y requiere nada más que una fuente de luz LED muy barata. Aquí, utilizamos proyección de imagen de FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) dibromuro de piridinio) a comparar y contrastar estos tres métodos diferentes de estimulación en la Drosophila NMJ: alta simple [K⁺ ], desafiando channelrhodopsin eléctricos y nuevos enfoques.