Beoordeling van de nierfunctie in muismodellen van glomerulaire ziekte

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de Britse wetgeving en de goedkeuring van de lokale ethisch comité. Dierlijke studies werden goedgekeurd door de Universiteit van Bristol onderzoek ethisch comité. 1. urine albumine Kreatinine Ratio (uACR) Opmerking: De uACR wordt gebruikt ter beoordeling van de permeabiliteit van de GFB aan albumine. De aanwezigheid van eiwit in de urine geeft verhoogde permeabiliteit over de GFB, die is genormaliseerd naar creatinine aan besturingselement voor variaties in het debiet van de urine. Albuminurie is een gemeenschappelijk marker voor chronische nierziekte. Verzamelen van urine op de experimentele basislijn en op gezette tijden (eenmaal per aan zodra maandelijkse) tot het experimentele eindpunt. Muis metabole kooien met water en verrijking dieet instellen. Muizen (mannelijke, leeftijd 6-8 weken) in afzonderlijke kooien voor 6 h in een stille ruimte plaatsen. Terugkeer muizen naar reguliere huisvesting en verzamelen urine uit de lege kooien. Een minimum van 50 µL is vereist.Opmerking: Als de muis geen urine in de bepaalde tijd produceert, herhalen op een andere dag in een warmere kamer. Centrifugeer de urine bij 500 x g gedurende 10 min. Verzamel de urine en sediment te beoordelen podocyte verlies te behouden. Bewaar de urine bij-20 ° C op de korte termijn op dit punt. Verdun de urine in 1% bovien serumalbumine (BSA) in 1 x Tris gebufferde zoutoplossing (TBS pH 7.5) op een 1:500 met 1:10000 verdunning, afhankelijk van de ernst van de albuminurie.Opmerking: Het einde volume moet > 400 µL. optimaliseren om te bepalen van de juiste verdunning op elk moment richt. Kwantificeren van de concentratie van de urine albumine met behulp van een muis albumine enzym gekoppelde immunosorbent analyse (ELISA) per de instructies van de fabrikant. Kort jas de ELISA-plaat, die is geoptimaliseerd voor binding aan eiwitten, met 100 µL van de anti-muis albumine primair antilichaam (10 µg Fe/mL in 0,5 M carbonaat-bicarbonaat pH 9,6) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De overtollige antilichaam Wash de putjes vijfmaal met 1 x TBS plus 0,05% Tween (pH 8,0), en voeg 200 µL van het blokkeren van de oplossing (1 x TBS met 1% BSA pH 8,0) ‘s nachts bij kamertemperatuur. Wassen plaat vijfmaal en voeg 100 µL van de normen (seriële verdunning: 2000 µg/mL tot 15.63 µg Fe/mL in 1 x TBS met 1% BSA, pH 8,0), de blanco, en de verwaterde monsters in drievoud. Laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, dan wassen plaat vijfmaal. Voeg 100 µL van HRP detectieantilichaam aan elk putje (10 ng/mL in 1xTBS met 1% BSA, pH 8,0) en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Wassen van de plaat vijfmaal en voeg 100 µL van enzym substraat oplossing aan elk putje. Laat de plaat in het donker ontwikkelen gedurende 15 minuten en stop de reactie door toevoeging van 100 µL van 0.18 M zwavelzuur (H2SO4).Let op: H2dus4 corrosief is. Bepaal de concentratie van de albumine van elk monster door het lezen van de plaat duikt met een extinctie van 450 nm. Gebruik de standaard curve te kwantificeren van de albumine aanwezig zijn in elk monster. Als de technische herhaalt een CV waarde meer dan 5% hebben, herhaalt u de bepaling voor deze monsters. U kunt ook beoordelen de concentratie van de urine albumine met behulp van elektroforese. Voeg toe 5 µL van 4 x eiwit monster laden buffer aan 15 µL van urine. Verwarm monsters tot 95 ° C gedurende 10 minuten en laadt vervolgens in een 4-12% Tris voorgegoten gel. De gel op 100 V en vlek ‘s nachts in Coomassie blue per fabrikant protocol worden uitgevoerd. Na de beeldvorming van de gel, door densitometrie te gebruiken om te beoordelen van albumine concentratie van de verandering van de vouw ten opzichte van controle.Opmerking: Indien geen banden worden waargenomen voor albumine wanneer verwacht, beoordeelt de eiwitconcentratie van de urine en regel het volume van de urine toegevoegd aan de gel. Het monster van het ruwe urine in dH2O op 1:1, 1:5 en 1:10 verdunnen.Opmerking: Het einde volume moet > 70 µL. optimaliseren om te bepalen van de juiste verdunning van elk monster. Kwantificeren van de concentratie van de urine creatinine met behulp van een chemische test per de instructies van de kit. Kort, laden 20 µL van creatinine normen, leeg, of verdunde urine aan een 96 goed plaat in drievoud. Bepaal de Kreatinine concentratie van elk monster door het lezen van de plaat duikt met een extinctie van 490 nm vóór en na de toevoeging van de zure oplossing (Let op, bijtende; aanraking met de huid vermijden).Opmerking: Het verschil tussen de waarden van de extinctie is recht evenredig met de Kreatinine concentratie in elk monster. Een standaard curve is de generatie van de normen. Als de technische herhaalt een CV waarde meer dan 5% hebben, herhaalt u de bepaling voor deze monsters. Het genereren van de uACR (µg/mg). Normaliseren van de gegevens op de waarde van de basislijn van elke muis voor grafische weergave. 2. de weefsels en bloed collectie Opmerking: De nier- en glomerulaire weefsel kunnen worden gebruikt ter beoordeling van de structuurfondsen, eiwit en mRNA expressie markers van nierziekte. Het bloed kan worden gebruikt ter beoordeling van de markers van nierfunctie, zoals creatinine, die kan omhoog-geregeld bij nierziekte, die een vermindering van de capaciteit van de filtratie van de glomeruli aangeeft. Voorbereiding van de volgende oplossingen: verse 2,5% Glutaaraldehyde in 0,1 M natrium cacodylate (pH 7.3), 4% paraformaldehyde in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), zoogdieren Ringer’s oplossing (115 mM natriumchloride (NaCl), 10 mM Natriumacetaat (CH3COONa), 1.2 mM natriumfosfaat (nb2HPO4) 25 MM natriumbicarbonaat (NaHCO3), 1.2 mM magnesium-sulfaat (MgSO4), 1 mM calciumchloride (CaCl2), 5,5 mM D (+)-glucose, pH 7.4) met 1% BSA en 1 x PBS.Let op: 2,5% Glutaaraldehyde: overgevoeligheid, toxisch, irriterend; gebruik in een zuurkast kast. 0,1 M natrium cacodylate: giftig, gebruik in een zuurkast kast. 4% PFA: fixeer, gebruik in de zuurkast kabinet Voorbereiding van de volgende materialen: Isofluraan, kleine ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)-gecoat bloed buizen, 23-25G naalden, 5 mL EDTA gecoat spuiten, 10 mL glazen flesjes, plastic flesjes van 10 mL, 0,5 mL plastic buizen, wegwerp weefsel mallen, droogijs, vloeibare N 2, chirurgische instrumenten van de muis, en optimale scherpe medium (OCT). Plaats de muis onder de diepe anesthesie, die wordt gecontroleerd door de muis wordt niet-reagerend aan een prik van de naald op de voetsteun, met behulp van een Isofluraan kamer, of gelijkwaardige routes van terminal anesthesie zoals injecteerbare verdoving agenten (pentobarbital, 50 mg/kg intraperitoneaal [IP]; «««Avertin, 240 mg/kg IP), of kooldioxide (CO2) blootstelling (75% CO2/25% O2). Ruiming muis via cardiale lekke band in het linkerventrikel en verzamelen van zoveel bloed mogelijk. Overbrengen naar de bloed EDTA-gecoate buis voor maximaal 4 uur. Indien gewenst, kunnen muizen via cervicale dislocatie worden afgemaakt met zorgvuldigheid niet te scheuren van de halsslagader. Ontleden uit de nieren via de buik en wassen in ijs koud 1 x PBS. Onderzoeken van de corticale glomeruli, verwijderen van één pool van nier cortex en snijd in 1 mm3 stuks. Herhaal de zelfde techniek met weefsel van de medulla te onderzoeken de diep juxta-Wallenberg glomeruli. Plaats in 5 mL 2,5% Glutaaraldehyde oplossing in een flesje van glas EM. Bewaren bij 4 ° C.Let op: 2,5% Glutaaraldehyde oplossing: overgevoeligheid, toxisch, irriterend; gebruik in een zuurkast kastOpmerking: proces binnen 1 maand voor de beste resultaten. Voor histologie, verwijder het bovenste derde van een nier, om ervoor te zorgen dat zowel corticale als juxta-Wallenberg glomeruli zullen aanwezig zijn, en positiebepaling in 5 mL 4% paraformaldehyde bij 4 ° C gedurende 24 h. overdracht tot 5 mL van 70% EtOH voor 24 uur voordat het inbedden in paraffine.Let op: 4% PFA: fixeer, gebruik in de zuurkast kabinet Voor immunofluorescentie, plaatst u een derde van de nier, om ervoor te zorgen dat zowel corticale als Wallenberg glomeruli zullen aanwezig zijn, in het weefsel schimmel en de vacht in oktober plaats op droog ijs om te bevriezen en opslaan bij-80 ° C. Voor eiwitten en RNA bevriezen plaats 3 x 2 mm3 stuks van nier cortex in 0,5 mL plastic buizen en module in vloeistof N2. Winkel bij-80 ° C. Voor langetermijnopslag weefsels voor RNA, plaatst u weefsel in 5 delen van RNA stabilisatie oplossing en opslaan bij-80 ° C. Voor het isoleren van de glomeruli, sneetje op de resterende nierweefsel en plaats in 5 mL van zoogdieren Ringer’s oplossing met 1% BSA op ijs. Voorbereidingen treffen voor de glomeruli onmiddellijk zeef. 3. de plasma Kreatinine Opmerking: De Plasma Kreatinine kan worden omhoog-geregeld bij nierziekte, die een vermindering van de capaciteit van de filtratie van de glomeruli aangeeft. Het bloed ureum stikstof (broodje) niveaus kunnen ook worden beoordeeld, hoewel het protocol wordt hier niet beschreven. Centrifugeer het bloedmonster bij 500 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Het verzamelen van het plasma, die kan worden opgeslagen bij-20 ° C op de korte termijn op dit punt. Kwantificeren van de plasma Kreatinine concentratie met behulp van een chemische creatinine assay per de instructies hierboven voor urine creatinine in protocol 1.11. Bepaal de Kreatinine concentratie van elk monster door het lezen van de plaat duikt met een extinctie van 490 nm vóór en na de toevoeging van de zure oplossing.Opmerking: Het verschil tussen de waarden van deze absorptie is recht evenredig met de Kreatinine concentratie in elk monster. Een standaard curve is de generatie van de normen. Als de technische herhaalt een CV waarde meer dan 5% hebben, herhaalt u de bepaling voor deze monsters. 4. isolatie van de Glomeruli Opmerking: Glomeruli kunnen worden geïsoleerd om te kunnen beoordelen van de permeabiliteit van individuele glomeruli ex vivo, evenals de expressie van specifieke proteïne en mRNA markers van glomerulaire ziekte. Neem het nierweefsel geplaatst in zoogdieren Ringer’s oplossing met 1% BSA en ontleden de glomeruli met behulp van een standaard zeven techniek13. Kort, stapelen de 70 µm (onder), 100 µm 125 µm, 175 µm, 250 µm en 425 µm (boven) zeven op een bekerglas van glas. Prak de nier, met behulp van een zuiger van de spuit, in de 425 µm zeef en doordrukken met behulp van ijs koud zoogdieren Ringer’s oplossing met 1% BSA. Zoals de bits van de nier worden doorgedrukt, verwijderen van de bovenste zeef en overgaan tot hetzelfde doen op de volgende. Herhaal totdat alleen de 100 µm en 70 µm zeven blijven. Overdracht van de glomerulaire oogst behouden door de 100 µm en 70 µm zeven tot 10 mL van de verse zoogdieren Ringer’s oplossing met 1% BSA, op ijs.Opmerking: Als het aantal glomeruli per mL Ringer’s oplossing weinig is, verminderen het volume van Ringer’s oplossing gebruikt voor het verzamelen van de glomeruli van de laatste twee zeven. Verwijderen van 5 mL van de oplossing met glomeruli in twee afzonderlijke buizen (elke 2.5 mL) en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en module bevriezen de glomeruli in vloeistof N2 alvorens bij-80 ° C voor eiwitten en RNA extractie op een later tijdstip op te slaan. Plaats de resterende oplossing met glomeruli in een waterbad bij 37 ° C voor meting van de glomerulaire LpA / Vikex vivo. Vul binnen 3 uur voor het verwijderen van de nier. 5. glomerulaire waterdoorlaatbaarheid (LpA / VIk) Opmerking: De glomerulaire LpA / Vik assay maakt de meting ex vivo van de permeabiliteit van individuele glomeruli in een snelle een reproduceerbare wijze. Een toename van de glomerulaire LpA / Vik geeft aan verstoring van de GFB, die is suggestief van nierziekte. Instellen van de glomerulaire LpA / Vik tuig in zalm et al.10beschreven. Zie afbeelding 1 voor een gedetailleerd diagram van de set-up. Voorbereiding van de volgende oplossingen: oplossing van de zoogdieren Ringer’s met 1% BSA (pH 7.4) en zoogdieren Ringer’s oplossing met 8% BSA (pH 7.4). Warm beide tot 37 ° C. Trek micropipetten uit glazen capillaire buizen (optische dichtheid: 1.2 mm). Een 5-8 µm diafragma tip genereren door het snijden van de micropipet onder een microscoop. Gebruik de glomerulaire LpA / Vik rig Overstaptijd intact individuele glomeruli die vrij zijn van Bowman van capsule en tubulaire fragmenten op de micropipet met behulp van zuiging. Een gedetailleerde samenvatting van de oncometric-bepaling wordt gevonden in zalm et al.10. Kortom, zodra een glomerulus is gevangen en beveiligd en op de zuig micropipet opgeslagen, beginnen met het opnemen van de video van de glomerulus onder de Microscoop. In de eerste plaats equilibreer de glomerulus in de 1% BSA Ringer’s oplossing voor 30 s voordat u de perifusate naar de geconcentreerde 8% BSA Ringer’s oplossing voor 10 s. Vervolgens schakelt u de perifusate terug naar 1% BSA Ringer’s oplossing en de opname tegenhouden. De glomerulus wegwassen en herhaal het proces voor 10-15 glomeruli per muis. Zorgen de stroomsnelheid van de perifusate zijn identiek en niet te snel (10 mL/min) om niet te verstoren de glomerulaire structuur. Meten van het oorspronkelijke tarief van glomerulaire krimp voor het berekenen van de glomerulaire waterdoorlaatbaarheid (LpA) genormaliseerd naar het glomerulaire volume (Vik). Gedetailleerde informatie met betrekking tot de analyse kan worden gevonden in zalm et al.10. 6. Periodieke Zure Schiff (BK) vlek Opmerking: De vlek PAS zal worden gewezen op de membranen van de kelder van glomerulaire capillaire loops en de tubulaire epitheel. Hierdoor gedetailleerde visualisatie van de glomerulaire cellen, mesangial matrix en potentieel expansie en eventuele veranderingen van de GBM (d.w.z., verdikking en onregelmatigheden). Het gedeelte van de paraffine-ingebedde, PFA-vaste nier cortex gebruikend microtome bij 5 µm dikte in poly-L-lysine gecoate dia’s. Droog bij 37 ° C gedurende 1 h. Controleer de sectie bevat geen plooien en de eventuele gaten, die de morfologie onder de Microscoop kunnen verstoren. Deparaffinize dia’s door aan het broeden tweemaal in xyleen (Let op, irriterend; gebruik in rook kabinet) gedurende 3 minuten elke, tweemaal in 100% EtOH gedurende 3 minuten elk, en vervolgens eenmaal in 95%, 70% en 50% EtOH gedurende 3 minuten elk, allemaal bij kamertemperatuur. Opnieuw het hydrateren van de dia’s in dH2O. Incubeer de dia’s in periodieke zure oplossing (Let op, irriterend; gebruik in rook kabinet) (1 g/dL) voor 5 min en dan spoelen de dia’s in diverse wijzigingen dH2O. gebruikt een container met 100 mL dH2O bij kamertemperatuur.Let op: periodieke zure oplossing: Irriterend; gebruik in de zuurkast kabinet Incubeer dia’s van Schiff van reagens (Parasoaniline HCl 6 g/L en natrium Metabisulfiet 4% HCl 0,25 mol/L) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Dia’s in stromend kraantjeswater gedurende 5 minuten wassen. Counterstain met haematoxyline voor 3 s voordat het grondig spoelen dia’s in stromend kraantjeswater voor 15 min.Opmerking: Sommige optimalisatie mogelijk moet bepalen van de optimale tijd voor Haematoxyline kleuring. Dia’s met behulp van het omgekeerde van het deparaffinization-protocol in stap 6.2 uitdrogen. Eindig met xyleen. Lucht droog dia’s en zware montering met montage xyleen gebaseerde media. Afbeelding op een lichte Microscoop bij 400 X vergroting te beoordelen glomerulaire structuren. Evalueren van het volgende: verdikking en onregelmatigheden van de GBM, instortende van capillaire lussen fibrotische weefsel, sclerose, cellulaire proliferatie (endotheel, podocyte, en mesangial, of ontstekingscellen infiltreren de tuft).Opmerking: Voor een uitgebreide evaluatie van glomerulaire pathofysiologie, letsels elders in de nier moeten worden geëvalueerd, zoals de tubuli. 7. transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) Opmerking: TEM maakt het mogelijk het onderzoek van ultra structurele afwijkingen in de nier, zoals de GBM podocyte voet processen en de endothelial fenestrations, die niet zichtbaar met de lichte microscopie zijn. Dit is belangrijk in de modellen waar nierschade niet zo uitgesproken is (dat wil zeggen, geen albuminurie en belangrijke structurele afwijkingen). Neem de 2,5% gluteraldehdye – vaste blokjes nier en na oplossen in 1% osmium tetroxide voor 1 h. wassen in 50 mL 0,1 M cacodylate buffer (pH 7.3) en vervolgens 50 mL dH2O (3 x 15 min veranderingen).Let op: 2,5% Glutaaraldehyde: overgevoeligheid, toxisch, irriterend; gebruik in een zuurkast kast. 0,1 M natrium cacodylate: giftig, gebruik in een zuurkast kast Met EtOH dehydrateren en inbedden in Araldite hars. Knip van de secties bij 50-100 nm dikte en vlek met 3% (waterige) uranyl acetaat en Reynolds voorsprong citraatoplossing. Digitale microfoto overnemen in verschillende gebieden van de glomerulus op 940 X, 1250 X, en 6200 X om er zeker van te zijn dat de podocytes, GEnCs, GBM en mesangium kunnen worden geïdentificeerd. Gebruik ImageJ voor het analyseren van de geblindeerde glomeruli. Stel de schaal voor elke opname 6200 X door het tekenen van een lijn tussen twee punten van bekende afstand, zoals een liniaal. Ga naar het analyseren en vervolgens Stel schaal, waar de lengte van de lijn zal worden weergegeven in pixels. Typ in de bekende afstand en meeteenheden. De protocollen voor het meten van elke parameter hieronder gebruiken.Opmerking: Deze analyse vereist ongeveer 1 dag per muis. Voor voldoende statistisch onderscheidingsvermogen, gebruikt u de gemiddelde metingen van 3 glomeruli van 3 muizen. Voor GBM, plaatst u een vaste digitale raster (10 x 10) over de opname van de 6200 X en meten van de dikte van de GBM op het punt waar de rasterlijnen de GBM kruisen. Meten van de basale endothelial cel membraan tot aan de celmembraan voor basale podocyte voet proces in een loodrechte raaklijn aan de endothelial cel membraan met behulp van de rechte lijn-tool. Bepaal de gemiddelde meting voor elke glomerulus uit 10 afzonderlijke metingen. Voor het nummer endothelial fenestration, meet de lengte van de GBM aanwezig zijn in de opname van de 6200 X en Tel het aantal endothelial fenestrations per eenheid lengte van GBM. Neem een gemiddelde van ten minste 4 microfoto per glomerulus. Voor de podocyte voet proces breedte, een vaste digitale raster (10 x 10) over de 6200 X opname invoegen. Meet de breedte van de podocyte voet processen die de grenzen van het raster. Meet de breedte op het breedste deel van het proces van de voet waar het samenkomt met de GBM; Zorg ervoor de lijn loodrecht op de tangens van de basale membraan van podocyte. Bepaal de gemiddelde meting voor elke glomerulus uit 10 afzonderlijke metingen. Podocyte Breedte gleuf, plaatst een vaste digitale raster (10 x 10) over de opname van de 6200 X. Meet de breedte van de gleuf het pessarium podocyte die de grenzen van het raster. Dit is het punt waar de voet processen dichtstbijzijnde samen op het breedste gedeelte van elke voet proces, van podocyte membraan aan membraan zijn. Zorg ervoor dat de meting staat loodrecht op de tangens van de basale membraan van podocyte. Bepaal de gemiddelde meting voor elke glomerulus uit 10 afzonderlijke metingen. Voor het aantal podocyte voet processen, meet de lengte van de GBM aanwezig zijn in de opname van de 6200 X en het aantal podocyte voet processen per eenheid lengte van GBM. Neem een gemiddelde van ten minste 4 microfoto per glomerulus. Zie gedetailleerde methode in Neal et al.voor de dekking van de sub-podocyte ruimte. 14. Met behulp van de 940 X microfoto, onderzoeken glomeruli voor de aanwezigheid van abnormale structuur, stortingen en infiltreert met het blote oog. 8. immunofluorescentietest voor Podocyte en endotheel Markers Opmerking: Immunokleuring kunt visualisatie van de eiwit-expressiepatronen, zoals endothelial capillaire lussen, die in de glomerulaire ziekte kunnen samenvouwen. Plaats de OCT-schimmel met bevroren nier bij-20 ° C gedurende 2 uur vóór het segmenteren. Ervoor zorgen dat het snijvlak van de nier wordt zorgvuldig geplaatst tegen de onderkant van de OCT-mal om goed georiënteerde weefselsecties. Met behulp van een cryostaat, bedekt sectie weefsel bij een 5 µm dikte aan poly-L-lysine dia’s.Opmerking: Zorg ervoor er zijn geen plooien of gaten in het weefsel gedeelte, dat de morfologie verstoren kan. Herstellen na verwijdering uit de cryostaat, dia’s in 4% PFA voor 10 min. Wash dia’s 3 x 5 min in een container met 100 mL voor dH2O.Let op: 4% PFA: fixeer, gebruik in de zuurkast kabinet Om te minimaliseren van de hoeveelheid antilichamen gebruikt, tekenen rond secties met een hydrofobe pen. Laat niet de secties droog. Incubeer oplossing (3% BSA en 5% normaal serum in 1 x PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te blokkeren. Verwijder de blokkerende oplossing met een aspirator en incubeer secties met primair antilichaam (Nephrin, podocin of PECAM-1) verdund 1:250 (3% BSA in 1 x PBS). Plaatsen van dia’s in een bevochtigde ruimte bij 4 ° C’s nachts. Als een vochtige kamer niet beschikbaar is, licht plaatst u een kleine strook van parafilm over de dia antilichaam-gecoat. Wees voorzichtig bij het verwijderen van de volgende dag over het niet verstoren van de sectie. Dia’s 3 x 5 min in 1 x PBS wassen. Incubeer met passende fluorescerende secundair antilichaam verdunning 1:1000 (3% BSA in 1 x PBS) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker. Dia’s 3 x 5 min in 1 x PBS wassen. Monteren met fluorescerende montage DAPI met media. Het imago van dia’s met een fluorescente microscoop bij 400 X vergroting te bekijken van de glomeruli. Zorgen voor dat dit om te voorkomen dat vooringenomenheid is verblind. Gebruik ImageJ voor het analyseren van de kleuring intensiteit, genormaliseerd naar het glomerulaire gebied, en het patroon van vlekken, dat wil zeggen, aantal capillaire lussen genormaliseerd naar het glomerulaire gebied, in een geblindeerde wijze. 9. eiwit extractie en het westelijke bevlekken Opmerking: Westelijke bevlekken laat ons toe om de expressie eiwitten bekend als dysregulated bij nierziekte beoordelen. Bijvoorbeeld, geeft een afname van de podocin en nephrin expressie podocyte verlies. Extract van eiwit van nier cortex en gezeefde glomeruli; het protocol is hetzelfde voor elk en het volume van lysis buffer is aangepast voor het bedrag van weefsel. Nier/glomeruli op ijs ontdooien voordat u NP-40 lysis buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris pH 8) met protease en phosphatase inhibitors toevoegt. Meng het monster voor 30 s. Incubeer de gehomogeniseerde monsters op ijs voor 30 min, vortexing op gezette tijden. Centrifugeer de monsters bij 10.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende substantie aan een verse buis op ijs.Opmerking: verwachten om te herstellen van ongeveer 1 mg eiwit per monster. Het denatureren van de proteïnen die met behulp van de standaard 4 x Laemmli buffer. Kook het mengsel bij 95-100 ° C gedurende 5 minuten. Beoordelen van de expressie van glomerulaire cel marker eiwitten (Nephrin, Podocin, PECAM-1, enz.) en de fosforylatie en expressie van eiwitten bekend/hypothetische worden aangepast in de nier/glomeruli van het model van de ziekte met behulp van westelijke bevlekken) standaardmethode; Mahmood en Yang15).Opmerking: Het protocol zal variëren afhankelijk van de grootte en de overvloed van de proteïne van belang. 10. RNA extractie en Polymerase-kettingreactie (PCR) Opmerking: mRNA uitdrukking analyse stelt ons in staat om te bepalen hoe genen bij nierziekte, zoals wijzigingen in genexpressie en alternatieve splicing worden geregeld. Terwijl de nier cortex nog steeds bevroren is, grondig in 3 mL reagens van fenol met behulp van een stamper en vijzel te vermalen. Als gebruikmaakt glomerulaire extracten, voeg 1 mL reagens van fenol en meng het monster voor 30 s.Let op: TRIzol-reagens: Irriterend; gebruik in de zuurkast kabinet Het uitvoeren van een RNA extractie met behulp van de methode beschreven door Chomczynski en Sacchi16.Opmerking: Commerciële RNA extractie kits zijn beschikbaar als alternatief voor deze methode. Het beoordelen van de kwantiteit en kwaliteit van RNA verkregen met behulp van een van de verschillende methoden beschikbaar. RNA is aliquoted en opgeslagen bij-80 ° C op dit punt. Voorkomen dat herhaling bevriezen ontdooien.Opmerking: Als nieuw voor deze methode, controleren de kwaliteit van het RNA voordat u verdergaat met de volgende stap door de RNA op een agarose gel om te zorgen voor een duidelijke 28 en 18S ribosomal band. Verwachten om te herstellen tussen 2 tot en met 5 µg van RNA met behulp van deze methode. DNase behandelen 1 µg RNA (make volume maximaal 10 µL met RNase-gratis water plus 1 µL van DNase en 1 µL van DNase buffer) gedurende 1 uur bij 37 ° C. Stop de reactie met 1 µL van DNase eindeoplossing bij 65 ° C gedurende 10 minuten. Voeg 0,5 µL van oligo (dT) en willekeurige inleidingen. Incubeer bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Doven onmiddellijk op het ijs gedurende 5 minuten. Voeg de volgende; MMLV reverse-transcriptase enzym (400 U; vervangen door DEPC H2O in de RT – controlemonster), MMLV buffer (1 x), dNTP mix (0.5 mM) en ribonuclease remmer (40 U); maken van maximaal 50 µL met DEPC water. Incubeer reactie mix bij 37 ° C gedurende 1 uur, gevolgd door 95 ° C gedurende 5 minuten aan het enzym deactiveren.Opmerking: Voor het genereren van een hogere opbrengst van cDNA, Incubeer bij 37 ° C gedurende maximaal 3 uur. Het beoordelen van de kwantiteit en kwaliteit van cDNA met behulp van de verschillende methoden beschikbaar. Gebruik PCR te beoordelen van de mRNA uitdrukking, egaliseren en lamineren patronen van genen veronderstelde te zijn dysregulated in het glomerulaire ziekte-model. Het protocol zal variëren afhankelijk van het gen van belang.