Оценка функции почек в моделях мыши клубочковых болезни

Все эксперименты проводились в соответствии с законодательством Великобритании и местные этического комитета утверждения. Исследования на животных были утверждены университет Бристоль Комитета по этике исследований. 1. моче альбумина креатинина соотношение (uACR) Примечание: UACR используется для оценки проницаемость GFB альбумина. Наличие альбумина в моче указывает на повышение проницаемости через GFB, который является нормализованным креатинина в элемент управления для изменения скорости потока мочи. Альбуминурия является общим маркером для хронической болезнью почек. Сбор мочи на экспериментальной базовой линии и на регулярной основе (один раз в неделю на один раз в месяц) вплоть до экспериментальной конечной точки. Настройка мыши метаболизм клеток с водой и обогащение диеты. Место мыши (мужчины, в возрасте 6-8 недель) в отдельных клетках для 6 h в тихой комнате. Возвращение мышей регулярные жилье и сбора мочи из пустых клеток. Требуется минимум 50 мкл.Примечание: Если мышь не производят мочи в данное время, повторите на другой день в комнате с подогревом. Центрифуга мочи на 500 x g 10 мин сбор мочи и сохранить осадков для оценки потери Подоцит. На данный момент магазин мочи при-20 ° C в краткосрочной перспективе. Разбавьте мочу в 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в 1 x Tris буфер солевой раствор (рН 7,5 TBS) на 1: 500 для разбавления 1: 10000, в зависимости от тяжести альбуминурии.Примечание: Объем конец должен быть > 400 мкл. оптимизировать определить правильный разрежения на каждом точку. Количественного определения концентрации альбумина мочи с помощью мыши альбумина энзим связанный assay иммуносорбента (ELISA) в инструкции производителя. Вкратце пальто ELISA плита, которая оптимизирована для связывания белков, с 100 мкл основное антитело против мыши альбумина (10 мкг/мл 0,5 М карбонат бикарбонат рН 9,6) за 1 ч при комнатной температуре. Избыточные антитела мыть из скважин пять раз с 1 x TBS плюс 0,05% анимации (рН 8,0) и 200 мкл преграждая разрешение (1 x TBS с 1% BSA pH 8.0) на ночь при комнатной температуре. Вымойте тарелка пять раз и 100 мкл стандартов (последовательного растворения: 2000 мкг/мл 15.63 мкг/мл в 1 x TBS с 1% BSA, рН 8,0), пустые и разбавленных образцы в трех экземплярах. Оставить на 1 час при комнатной температуре, затем промойте пластины пять раз. 100 мкл HRP обнаружения антител для каждой скважины (10 нг/мл в 1xTBS с 1% BSA, рН 8.0) и инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч. Вымойте тарелку пять раз и 100 мкл раствора субстрата энзима в каждой скважине. Оставьте пластину в темноте, чтобы разработать для 15 мин и остановить реакции, добавив 100 мкл 0,18 М серной кислоты (H2т-4).Предупреждение: H2так4 коррозионные. Определить концентрацию альбумина каждого образца, читая пластину на поглощение 450 Нм. Использование стандартной кривой для количественного определения альбумина, присутствующих в каждом образце. Если технические повторяет значение больше, чем 5% CV, повторите пробу для этих образцов. Кроме того оцените концентрацию альбумина мочи с помощью электрофореза. 5 мкл 4 x буфер загрузки образца протеина, чтобы 15 мкл мочи. Тепла образцов до 95 ° C 10 мин и затем загрузить в гель трис сборный 4-12%. Побегите гель на 100 V и пятно на ночь Кумасси синим за производителя протокол. После визуализации гель, используйте денситометрия оценить концентрацию альбумина изменения раза относительно элемента управления.Примечание: Если не полосы наблюдаются для альбумина, когда ожидалось, оценить концентрацию белка мочи и скорректировать объем мочи, добавляется гель. Разбавьте сырье мочи в dH2O 1:1, 1:5 и 1:10.Примечание: Объем конец должен быть > 70 мкл. оптимизировать определить правильный разбавления каждого образца. Количественно с помощью химического анализа в комплект инструкций концентрация мочи креатинина. Вкратце Загрузите 20 мкл креатинина стандартов, пустой, или разбавленных мочи до 96 хорошо пластины в трех экземплярах. Определение концентрации креатинина каждого образца, читая пластину на поглощение 490 Нм до и после добавления раствора кислоты (осторожно, коррозионные; избегать контакта с кожей).Примечание: Разница между значениями оптической плотности прямо пропорциональна концентрации креатинина в каждом образце. Калибровочной кривой это поколение от стандартов. Если технические повторяет значение больше, чем 5% CV, повторите пробу для этих образцов. Создание uACR (мкг/мг). Нормализовать данные базовой стоимости каждой мыши для графического представления. 2. ткани и крови коллекции Примечание: Почки и клубочковых ткани может использоваться для оценки структурных, белок и мРНК выражение маркеры почечной болезни. Кровь может использоваться для оценки маркеры почечной функции, такие как креатинин, который может быть вверх регулируется в почечной недостаточности, указывающее уменьшение возможностей фильтрации клубочков. Подготовить следующие решения: свежие глютаральдегид 2,5% в 0,1 М натрия cacodylate (рН 7.3), параформальдегида 4% в 1 x фосфатный буфер (PBS), раствор Рингера млекопитающих (115 мм хлорида натрия (NaCl), ацетат натрия 10 мм (CH3COONa), 1.2 Мм фосфат натрия (Na2HPO4), бикарбонат натрия 25 мм (3NaHCO), сульфат магния 1,2 мм (4MgSO), хлорид кальция 1 мм (2CaCl), 5,5 мм D (+) глюкозы, рН 7,4) с 1% BSA и ПБС.Предупреждение: 2,5% глютаральдегид: токсичные, сенсибилизатор, раздражающее; Используйте вытяжной шкаф. 0,1 cacodylate натрия М: токсичные, использование в вытяжной шкаф. 4% ПФА: фиксатор, использование в вытяжной шкаф Подготовьте следующие материалы: изофлюрановая, небольшой Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)-покрытием Трубы крови, 23-25G иглы, шприцы 5 мл ЭДТА покрытием, стеклянные флаконы по 10 мл, Пластиковые флаконы по 10 мл, 0,5 мл пластиковых труб, располагаемого ткани плесени, сухого льда, жидкость N 2, мышь хирургические инструменты и оптимального раскроя среднего (OCT). Поместите курсор мыши под глубокой анестезии, которая проверяется мышь, не отвечающих на укол иглой для ног колодки, используя камеру изофлюрановая, или эквивалентные маршруты терминала анестезии как инъекции анестетиков (Пентобарбитал, 50 мг/кг Внутрибрюшинное [IP]; ««Авертен, IP 240 мг/кг), или воздействия диоксида углерода (CO2) (75% CO2/25% O2). Отбирать мыши через сердца прокол в левый желудочек и собирать столько крови, как это возможно. Переезд в ЭДТА покрытием крови трубки для до 4 ч. Если предпочтительнее, мышей может взятые через шейки матки дислокации с осторожностью, чтобы не разорваться яремной вены. Вскрыть из почки через живот и вымыть в холодной ПБС льда. Для изучения корковых клубочков, удалить один полюс почки коры и разрезать на3 части 1 мм. Для изучения глубокие juxta Медуллярная клубочков, повторите ту же технику с ткани из продолговатого мозга. Место в 5 мл 2,5% раствора глютаральдегид во флаконе EM стекла. Хранить при 4 ° C.Предупреждение: 2,5% раствор глютаральдегид: токсичные, сенсибилизатор, раздражающее; использование в вытяжной шкафПримечание: процесс в течение 1 месяца для достижения наилучших результатов. Для гистологии, удалить верхней трети почек, обеспечить коркового и мозгового juxta клубочков будет присутствовать и исправить в 5 мл параформальдегида 4% при температуре 4 ° C для 24 h. передачи до 5 мл 70% EtOH за 24 часа до встраивания в парафин.Предупреждение: 4% ПФА: фиксатор, использование в вытяжной шкаф Для иммунофлюоресценции, место треть почки, чтобы обеспечить коркового и мозгового клубочков будет присутствовать в ткани плесени и пальто в октября место на сухой лед заморозить и хранить при температуре-80 ° C. Для белка и РНК место 3 x 2 мм3 куски коры почек в 0,5 мл пластиковых трубок и оснастки заморозить в жидкости N2. Хранить при температуре-80 ° C. Для длительного хранения тканей для РНК место ткани в 5 томах РНК стабилизации раствора и хранить при температуре-80 ° C. Для изоляции клубочков нарезать остальные ткани почек и место в 5 мл раствора Рингера млекопитающих с 1% BSA на льду. Подготовка к сита клубочков немедленно. 3. плазмы креатинина Примечание: Креатинина плазмы может быть вверх регулируется в почечной недостаточности, указывающее уменьшение возможностей фильтрации клубочков. Азота (БУЛОЧКИ) уровни мочевины в крови также могут быть оценены, хотя протокол не описано здесь. Центрифугуйте образцы крови на 500 g x 15 мин при 4 ° C. Сбор плазмы, которые могут храниться при температуре-20 ° C в краткосрочной перспективе на данный момент. Количественно с помощью химических креатинина пробирного инструкции выше для мочи креатинина в протоколе 1.11 концентрация креатинина плазмы. Определение концентрации креатинина каждого образца, читая пластину на поглощение 490 Нм до и после добавления раствора кислоты.Примечание: Разница между этими значениями оптической плотности прямо пропорциональна концентрации креатинина в каждом образце. Калибровочной кривой это поколение от стандартов. Если технические повторяет значение больше, чем 5% CV, повторите пробу для этих образцов. 4. изоляция клубочков Примечание: Клубочков могут быть изолированы для оценки проницаемость отдельных клубочков ex vivo, а также выражение определенного белка и мРНК маркеры клубочковых болезни. Возьмите почечной ткани, помещается в раствор Рингера-млекопитающих с 1% BSA и вскрыть клубочков, с помощью стандартного просеивание техника13. Вкратце стек 70 мкм (внизу), 100 мкм, 125 мкм, 175 мкм, 250 мкм и 425 мкм (сверху) сита на стеклянный стакан. Размять почки, используя поршень шприца, в 425 мкм сита и протолкнуть, используя лед холодной млекопитающих Рингера раствор с 1% BSA. Как протолкнула биты почки, удалить верхнего сита и приступить к делать то же самое на следующий. Повторите, пока только 100 мкм и 70 мкм сита остаются. Передача клубочковых урожай, удерживается 100 мкм и 70 мкм сита до 10 мл свежего млекопитающих Рингера раствор с 1% BSA, на льду.Примечание: Если количество клубочков в раствор Рингера мл несколько, сократить объем раствора Рингера, используемые для сбора клубочков от последних двух сита. Удаление 5 мл раствора, содержащего клубочков в два отдельных труб (по 2,5 мл) и центрифуги на 1000 x g 10 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и оснастки заморозить клубочков в жидкости N2 прежде чем убрать на-80 ° C для белков и РНК добыча на более поздний срок. Поместите оставшийся раствор, содержащий клубочков в водяной бане при 37 ° C для измерения клубочковых LpA / V,яex vivo. Завершите в течение 3 ч удаления почки. 5. клубочковых водопроницаемость (LpA / V,я) Примечание: Клубочковых LpA / Vя проба позволяет ex vivo измерения проницаемости отдельных клубочков в быстром воспроизводимый манере. Увеличение клубочковых LpA / V,я указывает нарушение GFB, который наводит на мысль о почечной болезни. Настройка клубочковых LpA / V,я установки, как описано в10лосося и др. Подробная схема настройки обратитесь к рис . Подготовить следующие решения: раствор Рингера-млекопитающих с 1% BSA (рН 7,4) и раствор Рингера-млекопитающих с 8% BSA (рН 7,4). Теплый и 37 ° C. Тянуть micropipettes из стеклянных капиллярных трубок (оптическая плотность: 1,2 мм). Генерировать кончик 5-8 мкм диафрагмы путем разрезания микропипеткой под микроскопом. Используйте клубочковых LpA / V,я сфальсифицировать поймать нетронутыми отдельных клубочков, которые свободны от Bowman’s капсулу и трубчатых фрагменты на микропипеткой, используя всасывания. Подробное резюме oncometric assay находится в10лосося и др. Короче говоря после glomerulus поймали и закрепляться на всасывания микропипеткой, начните запись видео glomerulus под микроскопом. Во-первых, сбалансировать glomerulus в растворе Рингера BSA 1% для 30 s перед переключением perifusate концентрированный 8% BSA раствор Рингера для 10 s. Затем включите perifusate обратно в раствор 1% BSA Рингера и остановить запись. Смыть glomerulus и повторите этот процесс для 10-15 клубочков на мышь. Обеспечение скорости потока perifusate идентичны и не быстро (10 мл/мин), чтобы не исказить клубочковых структуры. Измерьте начальную скорость клубочковой усадки для вычисления проницаемости клубочковых воды (LpA) нормированный клубочковых тома (Vя). Подробная информация относительно анализа можно найти в10лосося и др. 6. периодические кислоты Шифф (ССА) пятно Примечание: PAS пятно будет выделить подвале мембраны клубочковых капилляров петель и трубчатых эпителия. Это дает подробные визуализации клубочковых клеток, Мезангиальный матрицы и потенциал расширения и потенциальные изменения GBM (то есть, утолщение и нарушений). Раздел парафин врезанных, PFA-Исправлена почечной коры, используя микротом на 5 мкм толщина поли L-лизин покрытием слайды. Сухой при 37 ° C за 1 ч. обеспечить раздел не содержит любые складки или отверстий, которые могут исказить морфология под микроскопом. Deparaffinize слайды по инкубации дважды в ксилоле (осторожно, раздражающее; использование в кабинете дыма) 3 мин, дважды в 100% EtOH на 3 мин, а затем один раз в 95%, 70% и 50% EtOH 3 мин каждая, все при комнатной температуре. Повторно гидрата слайды в dH2O. Инкубируйте слайды в периодической кислоты раствор (осторожно, раздражающее; использование в вытяжной шкаф) (1 г/дл) для 5 минут, а затем промыть слайды в несколько изменений dH2O. используют контейнер с 100 мл dH2O при комнатной температуре.Предупреждение: периодическая кислоты раствор: раздражающее; использование в вытяжной шкаф Инкубируйте слайды в Шифф ‘s реагента (6 г/Л и натрия метабисульфит Parasoaniline HCl 4% HCl 0,25 моль/Л) для 15 мин при комнатной температуре. Вымойте слайды в проточной водой в течение 5 мин. Изображение с применением окрасок гематоксилин 3 s перед полосканием тщательно слайды в проточной водой в течение 15 мин.Примечание: Некоторые оптимизации может потребоваться определить оптимальное время для окрашивания гематоксилином. Обезвоживает слайдов, используя Обратный протокол депарафинизации в шаге 6.2. Закончить с ксилола. Воздух сухой слайды и горе с средствами массовой информации на основе ксилол монтажа. Изображение на световой микроскоп при 400-кратном оценить клубочковых структур. Оценить следующее: утолщение и нарушений GBM, рушится капиллярных петель, фиброзных тканей, склероз, пролиферации (эндотелия сосудов, Подоцит и Мезангиальный, или воспалительных клеток, проникнув клок).Примечание: Для всеобъемлющей оценки клубочковых патофизиологии, поражений других в почках должно быть оцененным, таких, как трубочки. 7. просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) Примечание: ТЕА позволяет изучение ультра-структурные аномалии в почках, например GBM, Подоцит ног процессы и эндотелиальных ярусе, которые не видны с световой микроскопии. Это важно в моделях, где почек ущерб произносится не так (то есть, не альбуминурия и основные структурные аномалии). Возьмите 2,5% gluteraldehdye – Исправлена кубиками почек и после исправления в 1% осмия тетраоксид за 1 ч. мыть в 50 мл 0,1 М cacodylate буфера (рН 7.3), а затем 50 мл dH2O (3 x 15 мин изменения).Предупреждение: 2,5% глютаральдегид: токсичные, сенсибилизатор, раздражающее; Используйте вытяжной шкаф. 0,1 cacodylate натрия М: токсичные, использование в вытяжной шкаф Обезвоживает с EtOH и внедрить в аралдита смолы. Вырезать секций на 50-100 Нм толщиной и пятно с 3% (водный) уранила ацетат и цитрата Рейнольдс свинца. Захватить несколько областей glomerulus в 940 X цифровой микроскопии, 1250 X и 6200 X чтобы podocytes, Генцс, GBM и mesangium можно определить. Для анализа ослепленный клубочков используйте ImageJ. Установите масштаб для каждого 6200 X Микрофотография путем рисования линии между двумя точками известных расстояния, таких как правитель. Перейти для анализа, а затем задайте шкала, где будет отображаться длину линии в пикселях. Введите известные расстояние и единиц измерения. Использование протоколов, перечисленных ниже для измерения каждого параметра.Примечание: Этот анализ требует около 1 день мыши. Для надлежащей статистической мощности используйте средняя измерений от 3 клубочков от 3 мышей. GBM вставить фиксированной цифровой сетки (10 x 10) за 6200 X Микрофотография и измерить толщину GBM в точке, где линии сетки пересекают GBM. Измерьте расстояние от базальной мембраны эндотелиальных клеток базальной Подоцит ног процесс клеточной мембраны в перпендикулярных касательной к эндотелиальной мембраны клетки, используя средство прямой линии. Определите средний измерения для каждого glomerulus из 10 отдельных измерений. Для числа эндотелиальной порозность измерить длину в 6200 X Микрофотография GBM и подсчитать количество эндотелиальных ярусе на единицу длины GBM. Длится в среднем от по крайней мере 4 микроскопии за glomerulus. Для Подоцит фут ширины процесса, вставить фиксированной цифровой сетки (10 x 10) над Микрофотография 6200 X. Измерьте ширину Подоцит ног процессов, которые пересекают линии сетки. Измерьте ширину в самой широкой части процесса ног, где он встречает GBM; Убедитесь, что линия перпендикулярна к касательной базальной мембраны Подоцит. Определите средний измерения для каждого glomerulus из 10 отдельных измерений. Для Подоцит щели шириной вставьте фиксированной цифровой сетки (10 x 10) над Микрофотография 6200 X. Измерения ширины диафрагмы Подоцит щели, которые пересекают линии сетки. Это та точка, где процессы ног ближе вместе, в самой широкой части каждого процесса ноги, от Подоцит мембраны для мембраны. Убедитесь, что измерение представляет собой перпендикуляр к касательной базальной мембраны Подоцит. Определите средний измерения для каждого glomerulus из 10 отдельных измерений. Количество Подоцит ног процессы, измерить длину в 6200 X Микрофотография GBM и подсчитать количество процессов Подоцит ног на единицу длины GBM. Длится в среднем от по крайней мере 4 микроскопии за glomerulus. Для охвата суб Подоцит пространства увидеть подробный метод в Нил и др. 14. С помощью 940 X микроскопии, изучите клубочков наличие ненормальной структуры, депозитов и инфильтраты, глаз. 8. иммунофлюоресценции для Подоцит и эндотелиальных маркеры Примечание: Иммуноокрашивания позволяет визуализацию шаблонов выражение, белка, например эндотелия капилляров петли, которые можно свернуть в клубочковых болезни. Место OCT-формы, содержащие замороженных почек при-20 ° C за 2 ч до разрезания. Убедитесь, что поверхности среза почки тщательно помещены против нижней части OCT-прессформы для включения разделов хорошо ориентированным ткани. С помощью криостат, раздел ткани на 5 мкм толщина на поли L-лизин покрытием слайды.Примечание: Убедитесь, что есть никаких складок или отверстия в разделе ткани, который может исказить морфологии. После удаления из криостата, исправить слайды в 4% PFA для 10 min. мыть слайды 3 x 5 мин в контейнере с 100 мл dH2O.Предупреждение: 4% ПФА: фиксатор, использование в вытяжной шкаф Чтобы свести к минимуму количество антител используемых, нарисуйте вокруг секции с гидрофобным пера. Не позволяйте разделы сухой. Инкубируйте в блокировании решение (BSA 3% и 5% нормальной сыворотки в ПБС) за 1 ч при комнатной температуре. Удалять блокирующие решение с аспиратором и инкубировать секции с основного антитела (Nephrin, podocin или PECAM-1) разводят 1: 250 (3% BSA в однократном ПБС). Место слайды в увлажненные камере при температуре 4 ° C на ночь. Если не доступен влажной камере, слегка место небольшую полоску парафина на слайд, антителами. Будьте осторожны при удалении на следующий день, чтобы не нарушить секции. Вымойте слайды 3 x 5 мин в однократном ПБС. Проинкубируйте с соответствующим флуоресцентные вторичное антитело разбавления 1: 1000 (3% BSA в однократном ПБС) за 2 ч при комнатной температуре в темноте. Вымойте слайды 3 x 5 мин в однократном ПБС. Крепление с флуоресцентных монтаж средств массовой информации, содержащие DAPI. Изображения слайдов с флуоресцентный Микроскоп при увеличении 400 X для просмотра клубочков. Убедитесь, что это ослепленный избежать предвзятости. ImageJ использование для анализа интенсивность окрашивания, нормированный клубочковых области, и шаблон окрашивание, то есть, количество капиллярных петель нормированный клубочковых район, ослепленный образом. 9. белка добычу и западный Blotting Примечание: Западный blotting позволяет нам оценить выражение белки, известно dysregulated в почечной болезни. Например снижение podocin и nephrin выражение указывает на потерю Подоцит. Экстракт белка от почечной коре и, котор фильтруют клубочков; Протокол является то же самое для каждого и объем буфера lysis корректируется на сумму ткани. Оттепель почек/клубочков на льду перед добавлением NP-40 лизис буфера содержащие ингибиторы протеазы и фосфатазы (150 мм NaCl, 1% NP-40, 50 мм трис pH 8). Однородный образца для 30 s. Инкубируйте гомогенизированных образцов на льду в течение 30 мин, vortexing на регулярной основе. Центрифугуйте образцы на 10000 x g 15 мин при 4 ° C. Удалите супернатант в свежий трубку на льду.Примечание: ожидаете восстановления приблизительно 1 мг белка на сэмпл. Денатурируйте белки, с использованием стандартной 4 буфера x Laemmli. Кипятите смесь на 95-100 ° C за 5 мин. Оценить выражение клубочковых клеток маркер белков (Nephrin, Podocin, PECAM-1, и т.д.) и фосфорилирования и экспрессию белков, известный/предположить, чтобы быть изменены в почки/клубочков модели болезни с помощью западных blotting) Стандартный метод; Махмуд и Ян15).Примечание: Протокол будет варьироваться в зависимости от размера и обилием протеина интереса. 10. РНК добыча и полимеразной цепной реакции (ПЦР) Примечание: анализ выражения мРНК позволяет нам определить, как гены, регулируются в почечной болезни, такие как изменения в экспрессии генов и альтернативного сплайсинга. Хотя коре почки по-прежнему заморожены, тщательно растереть в 3 мл реагента фенола с помощью пестика и минометов. При использовании клубочковых экстракты, добавьте 1 mL реагента фенола и гомогенизации образца для 30 s.Предупреждение: Тризол реагента: раздражающее; использование в вытяжной шкаф Выполните извлечение RNA, с помощью метода, описанного Chomczynski и Сакки16.Примечание: Коммерческие РНК добыча комплекты доступны в качестве альтернативы для данного метода. Оценить количество и качество РНК, полученные с помощью одного из различных доступных методов. РНК является aliquoted и хранятся при температуре-80 ° C на данный момент. Избежать повторения заморозить оттаивания.Примечание: Если новое в этот метод, проверьте качество РНК перед переходом к следующему шагу, запустив РНК на геле агарозы для обеспечения четкой 28S и 18S рибосомных band. Ожидаете, чтобы восстановить между 2-5 мкг РНК с помощью этого метода. DNase лечения 1 мкг РНК (сделать объем до 10 мкл с РНКазы свободной воды плюс 1 мкл DNase и 1 мкл буфера DNase) за 1 ч при 37 ° C. Остановите реакции с 1 мкл DNase стоп раствора при 65 ° C для 10 мин. 0.5 мкл oligo (dT) и случайных праймеров. Инкубируйте на 70 ° C на 10 мин. Немедленно утолите на льду на 5 мин. Добавьте следующее; MMLV фермента обратной транскриптазы (400 U; заменить DEPC H2O в RT – образец элемента управления), буфер (1 x), MMLV dNTP смеси (0,5 мм), а также рибонуклеаза ингибитора (40 ед); Сделайте до 50 мкл DEPC водой. Инкубируйте реакция смеси при 37 ° C за 1 ч, следуют 95 ° C за 5 мин для деактивации фермента.Примечание: Для создания более высокую доходность cDNA, инкубации при 37 ° C до 3 ч. Оценить количество и качество cDNA, используя различные методы. Использование ПЦР для оценки моделей выражение и сплайсинга мРНК генов предположить, чтобы быть dysregulated в модели клубочковых болезни. Протокол будет варьироваться в зависимости от гена интереса.