Évaluation de la fonction rénale chez les modèles murins de la maladie glomérulaire

Toutes les expériences ont été menées conformément à la législation britannique et à l’approbation du Comité d’éthique local. Les études animales ont été approuvés par l’Université de Bristol Research Ethics Committee. 1. urinaire albumine créatinine (uACR) Remarque : L’uACR est utilisé pour évaluer la perméabilité du GFB à l’albumine. La présence d’albumine dans les urines indique une perméabilité accrue à travers le GFB, qui est normalisé à la créatinine au contrôle des variations de débit urinaire. Albuminurie est un marqueur commun pour l’insuffisance rénale chronique. Collecte urine à la ligne de base expérimentale et à intervalles réguliers (une fois par semaine à une fois par mois) jusqu’au point de terminaison expérimentale. Mis en place des cages métaboliques souris avec alimentation d’eau et de l’enrichissement. Placez les souris (mâles, âgés 6-8 semaines) dans des cages individuelles pendant 6 h dans une pièce silencieuse. Retour souris à régulier du logement et de l’urine collecter des cages vides. Il faut un minimum de 50 µL.Remarque : Si la souris ne produit pas d’urine dans le temps imparti, recommencez un autre jour dans une pièce plus chaude. Centrifuger l’urine à 500 x g pendant 10 min. collecter l’urine et de retenir les sédiments afin d’évaluer la perte podocyte. Stocker l’urine à-20 ° C à court terme à ce stade. Diluer l’urine dans les 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) 1 x Tris buffered saline (pH 7,5 de TBS) à un 1/500 à une dilution de 1 : 10000, selon la gravité de l’albuminurie.Remarque : Le volume de fin doit être > 400 µL. point d’optimiser pour déterminer la bonne dilution à chaque fois. Quantifier la concentration d’albumine urinaire à l’aide d’une souris albumine dosage immunoenzymatique (ELISA) par les instructions du fabricant. En bref, enduire la plaque ELISA, qui est optimisée pour la liaison aux protéines, avec 100 µL de l’anticorps primaire anti-souris albumine (10 µg/mL à 0,5 M carbonate-bicarbonate pH 9,6) pendant 1 h à température ambiante. Lavage excès d’anticorps puits cinq fois avec 1 x TBS plus de 0,05 % de Tween (pH 8,0) et ajouter 200 µL de solution (1 x TBS avec un pH de 1 % BSA 8.0) du jour au lendemain à la température ambiante de blocage. Laver plaque cinq fois et ajouter 100 µL des normes (dilution en série : 2000 µg/mL à 15,63 µg/mL en 1 x TBS avec 1 % de BSA, pH 8,0), le blanc et les échantillons dilués en triple exemplaire. Laissez pendant 1 h à température ambiante puis laver plaque cinq fois. Ajouter 100 µL d’anticorps de détection HRP dans chaque puits (10 ng/mL chez 1xTBS avec 1 % de BSA, pH 8,0) et incuber à température ambiante pendant 1 h. Laver la plaque cinq fois et ajouter 100 µL de solution de substrat enzymatique dans chaque puits. Laisser la plaque dans l’obscurité pour développer pendant 15 minutes et arrêter la réaction en ajoutant 100 µL de 0,18 M d’acide sulfurique (H2SO4).ATTENTION : H2SO4 corrosif. Déterminer la concentration d’albumine de chaque échantillon en lisant la plaque à une absorbance de 450 nm. La courbe d’étalonnage permet de quantifier l’albumine présente dans chaque échantillon. Si les répétitions techniques ont une valeur de CV supérieure à 5 %, répétez le test pour les échantillons. Vous pouvez également évaluer la concentration d’albumine urinaire par électrophorèse. Ajouter 5 µL de 4 x mémoire tampon échantillon de chargement protéine à 15 µL d’urine. Faire chauffer les échantillons à 95 ° C pendant 10 min et ensuite charger dans un gel de Tris préfabriqué de 4 à 12 %. Exécutez le gel à 100 V et tache du jour au lendemain au bleu de Coomassie selon le protocole du fabricant. Après le gel de l’imagerie, utilisez densitométrie pour évaluer la concentration d’albumine pli changement par rapport au témoin.Remarque : Si aucune bande n’est observées lorsqu’on attend de l’albumine, évaluer la concentration de la protéine de l’urine et régler le volume d’urine ajouté au gel. Diluer l’échantillon d’urine brute en dH2O à 01:10, 1:5 et 1:1.Remarque : Le volume de fin doit être > 70 µL. optimiser pour déterminer la bonne dilution de chaque échantillon. Quantifier la concentration en créatinine urinaire à un dosage chimique selon les instructions du kit. En bref, charger 20 µL de créatinine normes, vide, dilué d’urine ou d’une plaque 96 puits en triple exemplaire. Déterminer la concentration de créatinine de l’échantillon en lisant la plaque à une absorbance de 490 nm avant et après l’ajout de la solution d’acide (attention, corrosive ; éviter tout contact avec la peau).NOTE : La différence entre les valeurs d’absorbance est directement proportionnelle à la concentration de créatinine dans chaque échantillon. Une courbe d’étalonnage est la génération des normes. Si les répétitions techniques ont une valeur de CV supérieure à 5 %, répétez le test pour les échantillons. Générer l’uACR (µg/mg). Normaliser les données de la valeur de référence de chaque souris pour une représentation graphique. 2. tissu et prélèvement sanguin Remarque : Les reins et les tissus glomérulaire peuvent servir à évaluer les marqueurs d’expression structural, les protéines et ADN messagère de l’insuffisance rénale. Le sang peut être utilisé pour évaluer les marqueurs de la fonction rénale, telles que de la créatinine, qui peut être régulée dans les maladies rénales, indiquant une diminution de la capacité de filtration des glomérules. Préparer les solutions suivantes : frais 2,5 % glutaraldéhyde dans cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,3), 4 % de paraformaldéhyde à 1 x tamponné phosphate salin (PBS), une solution de Ringer mammifères (115 mM chlorure de sodium (NaCl), acétate de sodium 10 mM (CH3COONa), 1.2 mM de phosphate de sodium (Na2HPO4), le bicarbonate de sodium (NaHCO3) 25 MM, 1,2 mM de sulfate de magnésium (MgSO4), chlorure de calcium 1 mM (CaCl2), D (+) glucose de 5,5 mM, pH 7,4) avec 1 % de BSA et 1 x PBS.ATTENTION : 2.5 % de glutaraldéhyde : toxic, sensibilisant, irritante ; utiliser dans une armoire de fumées. 0,1 cacodylate de sodium M : toxique, usage dans une armoire de fumées. 4 % PFA : fixateur, utilisation dans le cabinet de fumées Préparer les matériaux suivants : isoflurane, acide éthylènediaminetétraacétique petit (EDTA)-revêtement des tubes de sang, 23-25G aiguilles, seringues de 5 mL EDTA enduit, 10 mL flacons en verre, flacons en plastique de 10 mL, tubes en plastique de 0,5 mL, tissu jetable moules, glace sèche, liquide N 2, outils chirurgicaux de souris et support de coupe optimale (OCT). Placez votre souris sous anesthésie profonde, qui est vérifiée par la souris étant irrecevable à une piqûre d’aiguille à la garniture de pied, à l’aide d’une chambre d’isoflurane, ou voies équivalents d’anesthésie terminaux tels que des agents anesthésiques injectables (pentobarbital, 50 mg/kg intrapéritonéale [IP] ; avertin, IP 240 mg/kg), ou le dioxyde de carbone (CO2) exposition (75 % CO225 % O2). Abattre les souris par ponction cardiaque dans le ventricule gauche et de recueillir autant de sang que possible. Transférer dans le tube de sang EDTA-enduit jusqu’à 4 h. Si vous préférez, souris peuvent être abattus par dislocation cervicale avec soin ne pas de rupture de la veine jugulaire. Disséquer les reins à travers l’abdomen et les laver dans du PBS 1 x contre le rhume de glace. Afin d’examiner les glomérules corticales, supprimer un des pôles du cortex rénal et couper en morceaux de3 mm 1. Pour examiner les glomérules juxta-médullaire profonde, répétez la même technique avec les tissus de la moelle. Placer dans 5 mL de solution de glutaraldéhyde 2,5 % dans un flacon en verre de EM. Conserver à 4 ° C.ATTENTION : solution de glutaraldéhyde 2,5 % : toxic, sensibilisant, irritante ; utiliser dans une armoire de fuméesNOTE : processus au cours du mois pour des résultats optimaux. Pour histologie, enlever le tiers supérieur d’un rein, afin d’assurer des glomérules corticales et médullaires juxta seront présents et le fixer dans 5 mL de paraformaldéhyde à 4 ° C pendant 24 h. transfert à 5 mL de 70 % à 4 % EtOH pendant 24 heures avant l’intégration à la paraffine.ATTENTION : 4 % PFA : fixateur, utilisation dans le cabinet de fumées Pour l’immunofluorescence, placer un tiers du rein, afin d’assurer des glomérules corticales et médullaires seront présents, dans le tissu moule et le manteau en octobre Place sur la glace sèche pour congeler et stocker à-80 ° C. Pour les protéines et l’ARN, placer 3 x 2 mm3 morceaux du cortex rénal dans les tubes en plastique de 0,5 mL et snap gel en liquide N2. Conserver à-80 ° C. Pour le stockage de tissus à long terme pour l’ARN, placez le tissu en 5 volumes de la solution de stabilisation RNA et conserver à-80 ° C. Pour l’isolation des glomérules, découper le tissu rénal restant et placer dans 5 mL de solution de Ringer mammifères avec 1 % de BSA sur la glace. Préparez-vous à tamis glomérules immédiatement. 3. créatinine plasmatique NOTE : Créatinine plasmatique peut être régulée dans les maladies rénales, indiquant une diminution de la capacité de filtration des glomérules. La concentration d’azote (BUN) urée sanguine peut également être évaluée, bien que le protocole n’est pas décrit ici. Centrifuger l’échantillon de sang à 500 g pendant 15 min à 4 ° C. Recueillir le plasma, qui peut être conservé à-20 ° C à court terme, à ce stade. Quantifier la concentration de créatinine plasmatique à un dosage de créatinine chimique selon les instructions ci-dessus pour la créatinine urinaire en protocole 1.11. Déterminer la concentration de créatinine de l’échantillon en lisant la plaque à une absorbance de 490 nm avant et après l’ajout de la solution acide.NOTE : La différence entre ces valeurs d’absorbance est directement proportionnelle à la concentration de créatinine dans chaque échantillon. Une courbe d’étalonnage est la génération des normes. Si les répétitions techniques ont une valeur de CV supérieure à 5 %, répétez le test pour les échantillons. 4. isolement des glomérules Remarque : Les glomérules peuvent être isolés afin d’évaluer la perméabilité des glomérules individuels ex vivo, ainsi que l’expression de la protéine spécifique et des marqueurs d’ADN messagère de la maladie glomérulaire. Prendre le tissu rénal, placé dans une solution de Ringer mammifères avec 1 % de BSA et disséquer les glomérules à l’aide d’une norme technique13de tamisage. En bref, empiler les 70 µm (en bas), 100 µm, 125 µm, 175 µm, 250 µm et 425 µm tamis (en haut) sur une carafe en verre. Écraser le rein, à l’aide d’un piston de la seringue, dans le µm 425 tamis et faire passer à l’aide de glace froide mammifères de Ringer avec 1 % de BSA. Comme les bits du rein sont poussés à travers, enlever le tamis supérieur et continuez à faire de même sur l’autre. Répéter jusqu’à ce que seulement les 100 µm et 70 µm tamis demeurent. Transférer la récolte glomérulaire conservée par le µm 100 et 70 µm tamis à 10 mL de solution de Ringer mammifères frais avec 1 % de BSA, sur la glace.Remarque : Si le nombre de glomérules par une solution de Ringer mL c’est peu, réduire le volume de solution de Ringer utilisé pour recueillir les glomérules des dernière deux tamis. Prélever 5 mL de la solution contenant les glomérules dans deux tubes séparés (2,5 mL chacun) et centrifuger à 1 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et composant logiciel enfichable geler les glomérules dans liquide N2 avant de le stocker à-80 ° C pour les protéines et l’extraction de l’ARN à une date ultérieure. Placer le reste de la solution contenant les glomérules dans un bain-marie à 37 ° C pour la mesure de la glomérulaire LpA / Viex vivo. Terminer en 3 h d’enlever le rein. 5. perméabilité à l’eau glomérulaire (LpA / Vj’ai) Remarque : Le glomérulaire LpA / Vj’ai permet la mesure ex vivo de la perméabilité des glomérules individuels dans un jeûne de façon reproductible. Une augmentation de la glomérulaire LpA / Vj’ai indique perturbation de GFB, qui est évocatrice d’une maladie rénale. Mettre en place le glomérulaire LpA / Vj’ai gréer comme décrit dans le saumon et al.10. Veuillez vous reporter à la Figure 1 pour un plan détaillé de la mise en place. Préparer les solutions suivantes : une solution de Ringer mammifères avec 1 % de BSA (pH 7,4) et mammifères Ringer avec 8 % de BSA (pH 7,4). Chaud à 37 ° C. Tirez les micropipettes de tubes capillaires de verre (densité optique : 1,2 mm). Générer une astuce d’aperture 5-8 µm en coupant la micropipette sous un microscope. Utilisez le glomérulaire LpA / Vj’ai gréer pour attraper des glomérules individuels intacts qui sont exempts de la capsule de Bowman et tubulaires fragments sur la micropipette à l’aide de dragues. Un résumé détaillé de l’essai d’oncometric se trouve dans le saumon et al.10. En bref, une fois un glomérule est capturé et sécurisé sur la micropipette d’aspiration, commencer l’enregistrement de la vidéo du glomérule sous le microscope. Tout d’abord, équilibrer le glomérule dans le 1 % de Ringer BSA pour 30 s avant de passer la périfusées le concentré 8 % de Ringer BSA pour 10 s. Puis revenir la périfusées de 1 % Ringer BSA et arrêter l’enregistrement. Laver le glomérule et répétez le processus pour les glomérules de 10-15 par souris. S’assurer que les débits de périfusées sont identiques et pas de jeûner (10 mL/min) de manière à ne pas déformer la structure glomérulaire. Mesurer la vitesse initiale de rétraction glomérulaire pour calculer la perméabilité glomérulaire (LpA) normalisée au volume glomérulaire (Vi). On trouvera des informations détaillées relatives à l’analyse en saumon et al.10. 6. acide periodique Schiff (PAS) tache Remarque : La tache PAS mettra en évidence les membranes basales des boucles capillaires glomérulaires et l’épithélium tubulaire. Il permet la visualisation détaillée des cellules glomérulaires, mésangiales expansion de matrice et de potentiel et les changements éventuels de la GBM (c.-à-d., épaississement et irrégularités). L’article le cortex de rein de paraffine, PFA-correction à l’aide d’un microtome à 5 µm d’épaisseur sur glissières revêtus de poly-L-lysine. Sec à 37 ° C pendant 1 h. s’assurer que la section ne contient-elle pas plis ni trous, qui peuvent fausser la morphologie sous le microscope. Déparaffiner diapositives en incubant deux fois dans le xylène (attention, irritant ; utilisation au cabinet de fumées) pendant 3 min chacun, deux fois en 100 % EtOH pendant 3 min de chaque et puis une fois à 95 %, 70 % et 50 % EtOH pendant 3 min chacun, le tout à température ambiante. Réhydrater les diapositives de dH2O. Incuber les lames dans une solution acide périodique (attention, irritant ; l’utilisation des fumées Cabinet) (1 g/dL) pour 5 min et puis rincez les diapositives de plusieurs changements de dH2O. utilisent un récipient avec 100 mL dH2O à température ambiante.Mise en garde : solution l’acide périodique : irritant ; utiliser dans les fumées cabinet Incuber les lames dans le réactif de Schiff (Parasoaniline HCl 6 g/L et sodium métabisulfite 4 % en HCl 0,25 mol/L) pendant 15 min à température ambiante. Les lames à l’eau courante pendant 5 min. Contre-colorant avec l’hématoxyline pendant 3 s avant de rincer soigneusement les lames dans l’eau courante pendant 15 minutes.NOTE : Certaine optimisation peut être nécessaire pour déterminer le moment optimal pour la coloration hématoxyline. Déshydrater les diapositives à l’aide de l’inverse du protocole déparaffinage à l’étape 6.2. Terminer par le xylène. Air secs diapositives et monter avec les supports de montage à base de xylène. Image sur un microscope photonique à un grossissement de X 400 pour évaluer les structures glomérulaires. Évaluer ce qui suit : épaississement et les irrégularités de la GBM, effondrement des boucles capillaires, tissu fibreux, la sclérose en plaques, une prolifération cellulaire (endothélial, podocyte et mésangiales, ou des cellules inflammatoires, infiltrant la touffe).Remarque : Pour une évaluation complète de physiopathologie glomérulaire, lésions ailleurs dans le rein doivent être évaluée, comme dans les tubules. 7. transmission Electron Microscopy (TEM) Remarque : TEM permet l’examen des anomalies ultra-structurale dans le rein, comme le GBM, podocyte pied processus et endothéliales fenestrations, qui ne sont pas visibles avec la microscopie photonique. Ceci est important dans les modèles où atteinte rénale n’est pas si prononcé (c’est-à-dire, sans albuminurie et anomalies structurelles majeures). Prenez le rein en dés 2,5 % gluteraldehdye – fixe et fixer au tétroxyde d’osmium 1 % pendant 1 h. lavage dans 50 mL de tampon de cacodylate de 0,1 M (pH 7,3) et ensuite 50 mL de dH2O (changements de 3 x 15 min).ATTENTION : 2.5 % de glutaraldéhyde : toxic, sensibilisant, irritante ; utiliser dans une armoire de fumées. 0,1 cacodylate de sodium M : toxique, usage dans une armoire de fumées Déshydrater avec EtOH et incorporer en résine de l’Araldite. Coupes à l’épaisseur de 50 à 100 nm et coloration à l’acétate d’uranyle (aqueuse) de 3 % et de solution de citrate de plomb Reynolds. Prendre des photographies au microscope numériques sur plusieurs zones du glomérule à 940 X, 1250 X et 6200 X pour être sûr les podocytes, GCS, GBM et mesangium peuvent être identifiés. ImageJ permet d’analyser les glomérules aveugles. Définissez l’échelle pour chaque micrograph 6200 X en traçant une ligne entre deux points de distance connue, comme une règle. Allez à analyser et puis définissez échelle, où la longueur de la ligne s’afficheront en pixels. Tapez la distance connue et unités de mesure. Utiliser les protocoles listés ci-dessous pour la mesure de chaque paramètre.Remarque : Cette analyse nécessite environ 1 jour par souris. Pour une puissance statistique adéquate, utiliser les mesures moyennes de 3 glomérules de 3 souris. Pour GBM, insérer une grille fixe numérique (10 x 10) sur la micrographie de 6200 X et mesurer l’épaisseur de la GBM à l’endroit où croisent les lignes de la grille le GBM. Mesurer de la membrane basale des cellules endothéliale à la membrane des cellules basales podocyte pied processus dans une tangente perpendiculaire à la membrane des cellules endothéliale à l’aide de l’outil de ligne droite. Déterminer la valeur moyenne mesurée pour chaque glomérule de 10 mesures individuelles. Pour le nombre de fenestration endothéliale, mesurer la longueur de la GBM présent dans la micrographie de 6200 X et compter le nombre de fenestrations endothéliales par unité de longueur de GBM. Prendre une moyenne d’au moins 4 photographies au microscope par le glomérule. Pour le podocyte pied largeur de processus, insérer une grille fixe numérique (10 x 10) sur la micrographie de 6200 X. Mesurez la largeur des processus podocyte pied qui traversent les lignes de la grille. Mesurez la largeur à la partie la plus large du processus pied où elle rencontre le GBM ; s’assurer que la ligne soit perpendiculaire à la tangente de la membrane basale podocyte. Déterminer la valeur moyenne mesurée pour chaque glomérule de 10 mesures individuelles. Pour podocyte largeur de fente, insérer une grille fixe numérique (10 x 10) sur la micrographie de 6200 X. Mesurez la largeur des diaphragmes podocyte fente qui traversent les lignes de la grille. C’est le point où les processus de pied sont plus près de l’ensemble, la partie la plus large de chaque processus de pied, de podocyte membrane à membrane. S’assurer que la mesure est perpendiculaire à la tangente de la membrane basale podocyte. Déterminer la valeur moyenne mesurée pour chaque glomérule de 10 mesures individuelles. Pour le nombre de podocyte pied processus, mesurer la longueur de la GBM présent dans la micrographie de 6200 X et compter le nombre de processus de pied podocyte par unité de longueur de GBM. Prendre une moyenne d’au moins 4 photographies au microscope par le glomérule. Pour la couverture de l’espace sub-podocyte, voir la méthode détaillée dans Neal et al. 14. À l’aide de la microscopie X 940, examiner les glomérules de la présence d’une structure anormale, les dépôts et s’infiltre par oeil. 8. immunofluorescence pour Podocyte et marqueurs endothéliales NOTE : Immunomarquage permet la visualisation des patrons d’expression de protéines, telles que des boucles capillaires endothéliales, qui peuvent s’effondrer dans la maladie glomérulaire. Placer le moule en OCT contenant des reins congelé à-20 ° C pendant 2 h avant incision. S’assurer que la surface coupée du rein est soigneusement placée contre le fond du moule-OCT pour permettre des coupes de tissus bien orienté. À l’aide d’un cryostat, tissu de section sur une épaisseur de 5 µm à la poly-L-lysine enduite de diapositives.Remarque : Assurez-vous qu’il n’y a aucun plis ou les trous dans la section de tissus, qui peuvent fausser la morphologie. Lors du retrait du cryostat, Difficulté diapositives dans 4 % PFA pendant 10 min. Lavez glisse 3 x 5 min dans un contenant de 100 mL de dH2O.ATTENTION : 4 % PFA : fixateur, utilisation dans le cabinet de fumées Pour réduire la quantité d’anticorps utilisé, dessinez autour des sections avec un stylo hydrophobe. Ne laissez pas les sections à sec. Incuber en bloquant la solution (BSA 3 % et 5 % de sérum normal en solution 1 PBS x) pendant 1 h à température ambiante. Enlever la solution de blocage avec un aspirateur et incuber des sections avec l’anticorps primaire (néphrine, podocin ou PECAM-1) dilué 1/250 (3 % de BSA dans du PBS 1 x). Placer les lames dans une chambre humidifiée à 4 ° C durant la nuit. Si une chambre humide n’est pas disponible, légèrement recouvrir une petite bande de parafilm la diapositive revêtus d’anticorps. Faites attention en enlevant le lendemain quant à ne pas perturber la section. Les lames 3 x 5 min dans du PBS 1 x. Incubation avec l’anticorps secondaire fluorescent approprié dilution 1 : 1000 (3 % de BSA dans du PBS 1 x) pendant 2 h à température ambiante dans l’obscurité. Les lames 3 x 5 min dans du PBS 1 x. Monter avec fluorescentes montage média contenant DAPI. Diapositives d’image avec un microscope à fluorescence à un grossissement de X 400 pour afficher les glomérules. S’assurer que cela est aveuglé pour éviter les biais. Utilisation ImageJ pour analyser l’intensité de coloration, normalisée à la zone glomérulaire et le patron de coloration, c’est-à-dire, le nombre de boucles capillaires normalisés à la zone glomérulaire, d’une manière aveugle. 9. protein Extraction et Western Blot NOTE : Éponger occidental nous permet d’évaluer les protéines d’expression connues pour être la dysrégulation en insuffisance rénale. Par exemple, une réduction de l’expression podocin et néphrine indique podocyte perte. Extrait de protéines de cortex rénal et glomérules tamisées ; le protocole est le même pour chacun, et le volume de tampon de lyse est ajusté pour la quantité de tissu. Dégel rein/glomérules sur la glace avant d’ajouter la lyse NP-40 tampon contenant inhibiteurs de protéase et de la phosphatase (150 mM NaCl, 1 % NP-40, 50 mM Tris pH 8). Homogénéiser l’échantillon pendant 30 s. Incuber les échantillons homogénéisés sur glace pendant 30 min, Vortex à intervalles réguliers. Centrifuger les échantillons à 10 000 g pendant 15 min à 4 ° C. Retirez le surnageant dans un nouveau tube sur la glace.Remarque : s’attendre à récupérer environ 1 mg de protéine par exemple. Dénaturer les protéines en utilisant le tampon standard de x Laemmli 4. Faire bouillir le mélange à 95-100 ° C pendant 5 min. Évaluer l’expression des protéines de marqueur de cellules glomérulaire (néphrine, Podocin, PECAM-1, etc.) et de la phosphorylation et l’expression des protéines connues / l’hypothèse soit modifiée dans les rein/glomérules du modèle de la maladie à l’aide de Western Blot) méthode standard ; Mahmood et Yang15).Remarque : Le protocole variera selon la taille et l’abondance de la protéine d’intérêt. 10. RNA Extraction et amplification génique (PCR) NOTE : ARNm expression analyse nous permet de déterminer comment les gènes sont régulés dans les maladies rénales, tels que les changements dans l’expression des gènes et d’épissage alternatif. Tandis que le cortex rénal est encore gelé, broyer soigneusement dans 3 mL de réactif de phénol en utilisant un mortier et un pilon. Si vous utilisez des extraits glomérulaires, ajouter 1 mL de réactif de phénol et homogénéiser l’échantillon pendant 30 s.ATTENTION : Le réactif de TRIzol : irritant ; utiliser dans les fumées cabinet Effectuer une extraction de l’ARN à l’aide de la méthode décrite par Chomczynski et Sacchi16.NOTE : Commercial RNA extraction kits sont disponibles comme alternative à cette méthode. Évaluer la quantité et la qualité de l’ARN obtenue à l’aide d’une des diverses méthodes disponibles. L’ARN est aliquotés et congelés à-80 ° C à ce stade. Éviter de répéter gel dégel.Remarque : Si nouveau pour cette méthode, vérifiez la qualité de l’ARN avant de passer à l’étape suivante en exécutant l’ARN sur gel d’agarose pour assurer un clair 28 s et 18 s ribosomal bande. S’attendre à récupérer entre 2 à 5 µg d’ARN à l’aide de cette méthode. Traiter la DNase 1 µg d’ARN (volume de faire jusqu’à 10 µL d’eau exempte de RNase plus 1 µL de DNase et 1 µL de tampon de DNase) pendant 1 h à 37 ° C. Arrêter la réaction 1 µl de solution d’arrêt DNase à 65 ° C pendant 10 min. Ajouter 0,5 µL d’oligo (dT) et amorces aléatoires. Incuber à 70 ° C pendant 10 min. Étancher immédiatement sur la glace pendant 5 min. Ajouter ce qui suit : Transcriptase inverse MMLV (400 U ; remplacer par DEPC H2O dans le RT – témoin), tampon MMLV (1 x), inhibiteur de mix (0,5 mM) et ribonucléase dNTP (40 U) ; faire jusqu’à 50 µL d’eau DEPC. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 1 h, suivi de 95 ° C pendant 5 min désactiver l’enzyme.NOTE : Pour générer un rendement plus élevé de l’ADNc, incuber à 37 ° C pendant 3 h. Évaluer la quantité et la qualité de cDNA en utilisant diverses méthodes disponibles. Utilisation PCR afin d’évaluer les comportements d’expression et épissage des ARNm des gènes supposé être dysrégulation dans le modèle de la maladie glomérulaire. Le protocole variera selon le gène d’intérêt.