Optimering av Laser-Capture lokalt för isolering av enteriska ganglier från färskfryst mänsklig vävnad
Summary
Målet med detta protokoll är att erhålla hög integritet RNA prover från enteriska ganglier isolerade från ofixerade, nymalen resected mänskliga Tarmvävnaden använder laser fånga lokalt (LCM). Protokollet innebär att förbereda flash-frysta prover av mänskliga Tarmvävnaden, kryosnitt, enprocentig färgning och uttorkning, LCM, och RNA-extraktion.
Abstract
Syftet med denna metod är att erhålla hög integritet RNA prover från enteriska ganglier som samlats in från ofixerade, nymalen resected mänskliga Tarmvävnaden använder laser fånga lokalt (LCM). Vi har identifierat fem steg i arbetsflödet som är avgörande för att erhålla RNA isolat från enteriska ganglier med tillräckligt hög kvalitet och kvantitet för RNA-följande punkter Först när du förbereder Tarmvävnaden, måste varje prov ha alla överflödig vätska tas bort genom att läska före utplattning slemhinnorna så mycket som möjligt över botten av stora bas formar. Proverna fryses sedan snabbt ovanpå en slurry av torris och 2-methylbutane. Andra, vid snittning av vävnaden, det är viktigt att placera cryomolds så att intestinal sektioner parallella full planet i plexus myenteric, därmed ger den största ytan av enteriska ganglier per bild. Tredje, under LCM, polyeten napthalate (PEN)-membran diabilder har störst hastighet och flexibilitet i beskriver icke-enhetlig formerna av enteriska ganglier när samla enteriska ganglier. Fjärde, för tydlig visualisering av enteriska ganglier inom sektioner, etanol-kompatibel färgämnen, som tolyloxi Violet, erbjuder utmärkta bevarandet av RNA integritet i förhållande till vattenhaltiga färgämnen. Slutligen för utvinning av RNA från fångade ganglier observerat vi skillnader mellan kommersiella RNA extraktion kit som gav överlägsna RNA kvantitet och kvalitet, samtidigt som det eliminerar DNA kontaminering. Optimering av dessa faktorer i det nuvarande protokollet kraftigt påskyndar arbetsflödet och ger enteriska ganglier prover med enastående RNA kvalitet och kvantitet.
Introduction
Denna metod är utformad för att erhålla hög kvalitet RNA prover av enteriska ganglier från mänskliga Tarmvävnaden använder laser fånga lokalt (LCM). Protokollet beskrivs här har optimerats för att ge tillräcklig RNA kvalitet och avkastning för RNA-sekvensering (RNA-seq) och är avsedd att användas med nymalen resected, ofixerade, flash-fryst mänskliga Tarmvävnaden.
Funktionella mag- och tarm motilitetsrubbningar påverkar en av fyra personer i Förenta staterna. Det enteriska nervsystemet (ENS), även kallad den andra hjärna1, är ofta i centrum för dessa störningar, eftersom det spelar en avgörande roll i gut homeostas och motilitet. Manipulation av gut motilitet i allmänhet varit begränsad till kirurgisk resektion av aganglionic/noncontractile vävnad, kronisk koständring eller mediciner. Överraskande, återstår den full transkriptom av de vuxna ENS sekvenseras, kraftigt begränsa vår förmåga att identifiera molekyler inom det ENS som kan riktade farmaceutiskt eller utnyttjas i stamceller terapier.
Det finns relativt få metoder för att isolera RNA från mänskliga enteriska ganglier. Det första synsättet, cell dissociation2, kräver hög inkubation temperaturer och långa inkubationstider; både som är kända för att främja RNA nedbrytning och förändra den transkriptom2,3. Ett alternativt tillvägagångssätt, LCM, mer tillförlitligt bevarar transkriptom och skyddar RNA integritet. Även om flera studier har använt LCM samla ganglier från färskfryst mänskliga Tarmvävnaden4,5,6, dessa synsätt antingen hämmas av dålig RNA kvalitet och kvantitet, var ganska arbetsintensiva, eller behövs för modifiering av färgning eller RNA utvinning tekniker att arbeta i våra händer. Andra LCM protokoll utformat för att bevara RNA som hittades i LCM produkt manualer som tillhandahålls ytterligare förbättringar7,8, men anpassning behövdes när det gäller isolering av enteriska ganglier8, 9. av dessa skäl har vi utvecklat ett optimerat protokoll baserat på dessa resurser som ger betydande mängder av hög integritet RNA från mänskliga enteriska ganglier, har en relativt snabb arbetsflödet och ger konsekvent resultat över en stor antal prover.
I denna studie presenterar vi en sammanfattning av optimerade rutiner som underlättar isolering av hög integritet RNA från enteriska ganglier från opererande mänskliga Tarmvävnaden. Vår metod omfattar fem viktiga aspekter. Första, nymalen resected, ofixerade human intestinal prover bör trimmas till rätt storlek, har all överflödig fukt bort med en laboratorium vävnad och tillplattade i en stor bas mögel innan flash-frysning ovanpå en slurry av torris och 2-methylbutane (2 MB). Andra, histologisk delar av tarmen bör vara beredd att erhålla full planet i plexus myenteric i en bild, som erbjuder en stor nyttolast av enteriska ganglier. Framgång med detta steg är till stor del beroende av vävnad förberedelseprocessen. För det tredje, ganglier i ENS nonuniform struktur kräver användning av polyeten napthalate (PEN) membran diabilder6, som har störst hastighet och precision under processen LCM. Fjärde, etanol-kompatibel färgämnen, såsom tolyloxi violett, bör användas för att bevara RNA integritet medan färgning enteriska ganglier. Senast, RNA extraktionsprocessen är avgörande för ett lyckat resultat med RNA-följande punkter Vi sökte ett tillvägagångssätt av RNA-extraktion som producerar hög RNA integritet, maximerar RNA avkastning när start med små samlingar av enteriska ganglier, eliminerar DNA kontaminering och behåller så många RNA arter som möjligt.
Sammantaget optimering av dessa faktorer i den aktuella studien kraftigt påskyndar arbetsflödet och ger prov på enteriska ganglier med enastående RNA kvantitet och kvalitet. Resultaten har varit till stor del konsekvent mellan en betydande grupp av prover, som visar konsekvensen av detta synsätt. Vidare har vi använt dessa metoder framgångsrikt sekvensera dussintals RNA prover från enteriska ganglier. De strategier som markeras här kan också anpassas i stort för att utföra LCM av önskad ganglierna eller kärnor i perifera och centrala nervsystemet och andra fall som kräver isolering av hög kvalitet RNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta förfarande möjliggör effektiv insamling av talrikt enteriska ganglier som en källa att härleda RNA för RNA-följande punkter Här har vi påskyndat de processer som beskrivs i befintliga protokoll samtidigt maximally RNA integritet. Som alla stegen i proceduren är beroende av varandra, är det viktigt att alla problem elimineras från uppkomsten av studien och att alla prover är beredda som likaså till varandra som möjligt, att erhålla tillförlitlig RNA-följande punkter.
Fr?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma att givare och deras familjer som gjort detta arbete möjligt. Vi uppskattar också hjälp av personalen vid International Institute of Medicine och Tennessee givare tjänster för att hjälpa samordna insamling av vävnad används i denna studie. Detta arbete stöds av anslag från National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 till EMS2 och stipendium stöd från NIH T32-DK007673 till AMZ. Vi är tacksamma till personal vid Vanderbilt translationell patologi delade resursen för tillgång till LCM Instrument och råd om vävnad förberedelse. Vanderbilt vävnad patologi delade resursen stöds delvis av NIH grants P30-CA068485-14 och U24-DK059637-13. Vi tackar i genomet Technology Access Center i Department of Genetics vid Washington University School of Medicine för hjälp med genomanalys. GTAC är delvis stöds av NCI Cancer Center Support Grant #P30 CA91842 till Siteman Cancer Center och IKT/CTSA Grant #UL1TR002345 från National Center för forskning resurser (NCRR), en komponent av National Institutes of Health (NIH) och NIH Färdplan för medicinsk forskning. Denna publikation ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis de officiella syn på NCRR eller NIH.
Materials
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
Referenzen
- Gershon, M. D. . The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- . PALM Protocols – RNA handling Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011)
- . Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015)
- . Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3′ tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W. Laser capture. Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
