Stentor 에 중생의 연구 방법

1. 배양 Stentor 와 단일 셀 또는 셀 조각에서 Stentor 문화 Chlamydomonas reinhardtii 문화 Stentor위한 음식으로 사용할 준비. 상업적인 공급자 (자료 테이블)에서 Chlamydomonas reinhardtii 셀을 가져옵니다. 메 마른 기술13를 사용 하 여 상업적으로 이용 가능한 탭 미디어에 Chlamydomonas reinhardtii 의 500 mL 액체 문화를 설정 합니다. 일주일에 두 번 탭 미디어와 그것을 diluting 하 여 램프 아래 Chlamydomonas 문화 (약 1의 마약)에서 채도 근처 농도 유지.참고: Chlamydomonas 문화 통에 성장 될 수 있다. 정기적으로 문화의 한 방울 슬라이드에,는 coverslip로 덮고 놓고 40 X 확대 현미경 검사 Chlamydomonas 문화 건강 인지 확인 하십시오.참고: Stentor 먹이 세균으로 오염 되 또는 Chlamydomonas 셀 클러스터로 집계 하는 경우에 대 한 문화를 사용 하지 마십시오. 이러한 문제 중 하나가 발생 하면, 새로운 Chlamydomonas 문화 시작. 상업적인 공급자 (자료 테이블)에서 Stentor coeruleus 셀을 가져옵니다. Stentor 세포는 필요한 경우 그들의 자연 서식 지에서 연못, 호수 또는 강11에서 그들을 수집 합니다. 수집 Stentor 연못, 호수 또는 강, 물이 상대적으로 그늘, 조용 하 고 분명 일부 식물 지역 찾아.참고: 찾는 Stentor 내려면 성장 위치에서의 더 높은 확율이 있다. 부 어 쉽게 용기에 물 2 리터 이상 수집 합니다. 암 및 미 립 자 물질 컨테이너의 하단에 정착, 한 후 부드럽게 Stentor, 대형 컨테이너에 정착 암 설에 대 한 각 컬렉션 후 몇 초 동안 대기에 대 한 검사를 몇 가지 작은 컨테이너를 입력 합니다. 샘플의 수집 위치에 완료 되 면 적어도 10 m 거리는 새 위치로 이동 하 고 거기 샘플의 컬렉션을 반복.참고: 모든 연못 인구가 Stentor , 그래서 여러 연못 수 샘플링을 할 수 있습니다. 실험실 샘플으로 돌아갑니다 하 고 개별 접시에 물 컨테이너에서 전송. 각 페 트리 접시에 5 배 확대에 비스듬한 빛 stereomicroscope Stentor 에 대 한 검색. 저온 살 균된 상용 샘물 (PSW)의 적어도 100 µ L를 포함 하는 유리 자리 접시의 우물에 1 mL 피 펫을 사용 하 여 개별 Stentor 셀을 전송 합니다.참고: Stentor 세포 기판 (그림 1)에 연결 하는 경우 나 팔 모양에 있다. 수영 Stentor 세포는 기질 (비디오 1)에 연결 된 셀 보다 덜 확장. PSW 적어도 3 Stentor 워시 x. 세척 Stentor 셀에 잘 유지 하면서 우물에서 물의 약 90%를 제거 하 여 수행 우물에 PSW의 500 µ L을 추가 하 여 다음.참고: Stentor 펫 피 펫 팁 10 µ L의 또는 더 작은 사용 하 여 처리 하기 전에 잘라 큰 셀 흐르는 생성 되는 전단 세력으로 인해 셀 부상 방지를 위로 피 펫 팁의 끝에서 약 0.5 m m 팁 op의 너무 작은 ening입니다. 각 Stentor의 먹이 기 전에 Chlamydomonas 를 준비 합니다. Chlamydomonas 문화 단계 1.1에서 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 준비의 1 mL를 전송 합니다. 3 분 2,095 x g에서 원심. 제거는 상쾌한 고 PSW의 1 mL에 펠 릿을 resuspended. 2,095 x g 3 분 제거는 상쾌한에 centrifuge 고 PSW의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend.참고: 따라서, 세척 하 고 집중된 Chlamydomonas 참조 됩니다 “Chlamydomonas”준비로 다음 단계에서. 탭 미디어 Stentor, 따라서 Stentor 먹이 것이 중요 하기 전에 Chlamydomonas 를 세척에 유해 하다.입니다. 클론 Stentor 문화, 필요한 경우 개별 Stentor 셀 또는 셀 조각에서 문화를 시작 합니다. 때문에 단일 Stentor 셀 PSW에서 잘 성장 하지 않는다, 필터 미디어는 기존, 건강 Stentor 문화에서의 500 µ L를 살 균 하 여 바른된 미디어를 준비 합니다. 유리 자리 접시의 우물 중 하나에 500 µ L의 조건된 미디어를 전송 합니다. 한 Stentor 조건된 미디어를 포함 하는 유리 자리 접시의 우물에 전송 합니다. 사용 가능한 작은 매체로 전송. 모든 48 h 준비 Chlamydomonas 의 각 Stentor 5 µ L를 피드. 때 Stentor 분할, 우물에 있는 셀의 수를 계산 하 고 셀 당 준비 된 Chlamydomonas 의 5 µ L를 추가 합니다. 그늘진된 장소에서 계속 Stentor 이후 셀 (예를 들어 투명 한 플라스틱 상자 종이 타 올으로 덮여)에 빛에 민감합니다. 신선한 조절된 매체 모든 96 h와 잘에서 Stentor 매체를 교환 합니다. 1.5.1 단계에서 신선한 조건된 미디어를 준비 합니다. 부드럽게 잘에서 아래로 액체 pipetting 우물의 바닥에서 분리 모든 Stentor 셀을 확인 합니다. 신중 하 게 잘 사용 하는 모든 셀에는 잘 남아 있는지 1 mL 피 펫에서 액체 발음. 우물에 신선한 바른된 미디어의 500 µ L를 추가 합니다. 잘 셀 수 20을 초과 하면 더 큰 컨테이너, 예를 들어 넓은 입 유리 항아리에 셀을 이동 합니다. 압력가 넓은 입 유리 항아리에 PSW의 20 mL를 추가 합니다.참고: Stentor 에 대 한 유리의 압력가 마로 소독 세척을 조심 하 고 rinsing 교체할 수 있습니다. 조심 스럽게 미디어를 위쪽 및 아래쪽 플라스틱에 우물의 바닥에서 모든 셀을 분리를 잘. 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 모든 Stentor 셀을 수집 하 고 부드럽게 유리 항아리에 그들을 전송. Stentor 문화, 공기에 대 한 충분 한 액세스를 허용 하도록 함께 항아리에 뚜껑을 조여 하지 마십시오. 약 20 셀/mL에서 Stentor 밀도 유지를 항아리 마다 48 h에 PSW를 추가 합니다. 눈으로 셀의 밀도 견적 한다.참고: 또는, 문화의 1 mL를 피펫으로 벽에서 분리 하 고 피 펫 팁에 있는 셀의 개수를 셀 수 있도록 항아리에 거품 공기 1 mL 피 펫을 사용 합니다. 모든 48 h Stentor 문화 단지 (단계 1.4 참조)에 대 한 피드 Chlamydomonas 준비. 준비 된 Chlamydomonas의 200 µ L로 문화를 먹이 함께 시작 합니다. 문화의 볼륨 증가, 점차 준비 Chlamydomonas 먹이 1 mL에 대 한 사용의 양을 증가 합니다. 문화 볼륨 항아리의 능력의 약 90%를 도달 하는 때, 더 큰 컨테이너에는 문화를 전송 합니다. 유리에서 Stentor 분리를 1 mL 피 펫과 항아리, 내부 문화를 아래로, 플라스틱. 2 컵 유리 용기에 병의 전체 내용을 부 어. PSW의 나머지 Stentor수집 2 컵 유리 용기에 약 25 mL와 함께 항아리를 씻어. 2 컵 유리 용기에 건강 한 문화를 유지 합니다. 4-5 일 마다 Stentor 문화 문화의 100 mL 당 준비 된 Chlamydomonas 의 2 개 mL를 피드. 추가 PSW 유리 컨테이너에 4-5 일 마다 약 20 셀/mL에서 Stentor 밀도 유지 합니다.참고: 450 mL 2 컵 컨테이너를 보유 하 고 최대 볼륨입니다. 일주일에 한 번 검사 해 부 현미경 rotifers, 곰 팡이, 그리고 다른 성장에 대 한 X 5에서 문화. 문화의 건강, 연장 1 mL 피 펫을 사용 하 여 비정상적으로 모양 하 고 무색 Stentor 셀 함께 오염 미생물을 제거 합니다. 유리 컨테이너는 전체 약 90% 때 분할 문화. 유리 컨테이너에 PSW 25 mL를 추가 합니다. Stentor 유리에서 분리 하려면 아래로 25 mL 피 펫 피 펫을 사용 합니다. 문화의 약 50%는 새로운 2 컵 유리 컨테이너에 이동 합니다. 두 문화에 PSW 25 mL를 추가 하 고 프로토콜의이 섹션에 설명 된 대로 두 개의 문화를 유지 하는 계속.참고: Stentor 세포 높은 온도에 민감한 때문에, 문화 유지 됩니다 방에 온도 25 ° c 이하로 유지 합니다. 또는, 문화 인큐베이터에 보관 될 수 있습니다. Stentor 경작의 문제 해결 표 1 을 참조 하십시오. 2. 절단 Stentor 세포 재생을 유도 다음과 같이 프로그램을 사용 하는 모 세관 튜브에서 여러 바늘을 바늘 끌어당기는 사람을 사용 하 여: 열-735, 풀-100, 110, 시간-속도 150, 압력-400. PSW 50 mL에 4% 스 솔루션을 준비 합니다. 스의 1 g 추가 (점도: 1500 cP) PSW의 50 ml. 스의 해체를 촉진 하기 위하여 적어도 8 h 4 ° C에서 품 어. 실 온에서 4% 스 솔루션을 유지. 인하를 수행한 후 셀 파편을 저장 하기 위한 자리 유리 접시를 준비 합니다. 필터 미디어는 건강 한 문화, 잘 필요한 자리 유리판 당 500 mL를에서 소독. 필요한 우물의 각 소독된 미디어의 500 mL를 전송 합니다. 2 µ L 방울에 한 건강 한 Stentor (정의 된 트럼펫 모양, 선명한 블루-그린 색상, 그리고 더 큰 그들 데)를 수집 하 고 coverslip 또는 슬라이드에 배치. 4% 스 (그림 2)의 2 µ L를 추가 합니다. Stentor (동영상 2) 절단 하기 전에 천천히 하자. 바늘을 침입을 방지 하기 위해 가능한 절단 표면에 평행으로 유리 바늘을 잡으십시오. 해 부 현미경 스테레오를 사용 하 여 유리 바늘의 팁 찾아서 셀 (그림 3A)에 가까이 이동 합니다. 바늘 (그림 3B와 C)과 접촉 시 Stentor 계약을 관찰 합니다.참고: 셀이 어려운 후부 끝에서 앞쪽 끝을 분리 하는 방향으로, 회전 그것은 매우 부드럽게 바늘의 측면. 조심 스럽게 두 셀을 잘라 유리 바늘의 측면과 Stentor 계약된 누릅니다(그림 3D 및 E, 비디오 3). 2 개의 파편 떨어져 그들을 피하기 위해 조각 퓨전 사이 세포질 연결 되도록 이동 (그림 3 층). 두 조각 간접 조명 해 현미경 파편을 검사 하 여 각 하나 이상의 macronuclear 노드를가지고 여부를 확인 합니다.참고: macronuclear 노드를 하나 이상 갖는 세포 생존을 위해 필수적입니다. 셀 수 있습니다 동안 이나 컷 청록색 안료와 함께 자사의 박막 (투명 셸) 창. 대부분의 경우에서이 셀의 장기적인 생존 능력 영향을 주지 것입니다. 준비 단계 2.3에서 유리 자리 접시의 우물에 조각을 이동 합니다. 잘라 셀의 일부분을 다시 생성 하지 것입니다 때문에 여러 셀을 잘라. 한 세션에서 여러 컷을 수행 하는 경우 대체 유리 바늘 Stentor 잔류물 또는 팁 깨졌습니다 코팅 무 겁 게 된다 때. 또는 부드럽게 실리콘 스페이서의 조각에 그것을 닦아 하 여 바늘을 청소.참고: 유리 바늘 여러 셀 절단 세션 사용할 수 있습니다. 습도 챔버에 세포 파편 자리 유리판을 유지. 이미징에 대 한 자세한 내용은 프로토콜의 섹션 4와 Stentor 재생 결과의 해석을 진행 합니다. 3. Membranellar 밴드 및 자당 또는 요소 치료 구강 장치의 재생을 유도 자당을 사용 하 여 Membranellar 밴드와 구강 장치 제거 PSW에 자당의 25% 솔루션을 준비 합니다. PSW에 스냅 캡 microcentrifuge 튜브 25% 자당의 500 µ L를 추가 합니다. 자당 치료 후 셀을 세척을 위한 3 microcentrifuge 튜브 각 튜브에 PSW의 1 mL와 스냅 모자를 준비 합니다. 1 mL 피 펫 (그림 4, 화살표 A)를 사용 하 여 별도 microcentrifuge 관으로 그들의 문화 미디어의 1 mL에 30-60 Stentor 세포를 수집 합니다. 125 µ L 최종 볼륨 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 단일 무승부에에 튜브에서 모든 세포를 수집 합니다. 20% 자당 솔루션 (그림 4, 화살표 B)의 625 µ L를 25% 자당 (단계 3.1.2에서에서 준비)의 500 µ L로 튜브를 그들을 전송. 스톱 워치를 시작 합니다. 이 20% 자당 해결책에 톡-스핀 1 분 동안 랙에서 microcentrifuge 튜브 Stentor 를 품 어. 하나의 무승부에 있는 모든 셀을 수집 (쉽게 컬렉션에 대 한 200 µ L 최대 용량 피펫으로 조정). 초시계 자당 치료의 2 분 표시 될 때까지 피 펫 팁에 셀을 계속. Microcentrifuge 튜브 3.1.3 (그림 4, 화살표 C) 단계에서 준비의 하나로 Stentor 를 꺼냅니다. 영화-스핀 랙에서 튜브입니다. 두 번 더, 한 번 PSW를 포함 하는 microcentrifuge 튜브 남은 두의 각 준비 단계 3.1.3 (그림 4, 화살표 D와 E)에서 세포를 씻어.참고: 단일 그리기 셀 컬렉션 기술은 세척 사이 중요 하지 않습니다. 이미징에 대 한 자세한 내용은 프로토콜의 섹션 4와 Stentor 재생 역학 (그림 4, F와 G 화살표)의 해석을 진행 합니다. 요소를 사용 하 여 Membranellar 밴드와 구강 장치 제거 PSW에 4% 우 레 아의 솔루션을 준비 합니다. PSW에 스냅 캡 microcentrifuge 튜브 4% 우 레 아의 300 µ L를 추가 합니다. 셀 요소 처리 후 세척을 위한 각 관에서 PSW의 1 mL를 포함 하는 스냅인 모자 3 microcentrifuge 튜브를 준비 합니다. 1 mL 피 펫 (그림 4, 화살표 A)를 사용 하 여 별도 microcentrifuge 관으로 그들의 문화 미디어의 1 mL에 30-60 Stentor 세포를 수집 합니다. 300 µ L 최종 볼륨 1 mL 피 펫을 사용 하 여 단일 무승부에에 튜브에서 모든 세포를 수집 합니다. 2% 요소 솔루션 (그림 4, 화살표 B)의 600 µ L를 그들 4% 우 레 아 (단계 3.2.2에서에서 준비)의 300 µ L와 튜브 전송. 스톱 워치를 시작 합니다. 이 2% 우 레 아 해결책에 톡-스핀 1 분 동안 랙에서 microcentrifuge 튜브 Stentor 를 품 어. 하나의 무승부에 있는 모든 셀을 수집 합니다. 초시계 요소 치료의 2 분 표시 될 때까지 피 펫 팁에 셀을 계속. 3.2.3 (그림 4, 화살표 C) 단계에서 준비 microcentrifuge 튜브의 하나로 Stentor 를 꺼냅니다. 영화-스핀 랙에서 튜브입니다. 두 번 더, 한 번 PSW를 포함 하는 microcentrifuge 튜브 남은 두의 각 준비 단계 3.2.3 (그림 4, 화살표 D와 E)에서 세포를 씻어.참고: 단일 그리기 셀 컬렉션 기술은 세척 사이 중요 하지 않습니다. 이미징에 대 한 자세한 내용은 프로토콜의 섹션 4와 Stentor 재생 역학 (그림 4, F와 G 화살표)의 해석을 진행 합니다. 4. 이미징 및 세포 재생 분석 교수형을 사용 똑바로 현미경을 사용 하 여 개별 셀의 이미지 재생 방울 방법. 유리 자리 접시의 우물에 PSW의 100 µ L를 넣어. 문화 미디어 (그들은 미디어)의 4 µ L에 1 Stentor 셀을 분리, 플라스틱 10 또는 20 µ L를 사용 하 여. 22 x 22 m m2 coverslip (그림 5)의 한가운데에 작은 물방울을 예금 한다.참고: 경우 셀에는 1) 건강에 해로운 (비정상적으로 모양 또는 무 겁 게 vacuolated) 또는 2) 아직도 membranellar 밴드 또는 구강 기관 (대 한 화학 치료 실험), 이미징에 사용 하지 마십시오. 작은 물방울 사이 충분 한 공간을 떠나 하는 동안 이전 방울 주위 문화 미디어에서 Stentor 4 더 많은 방울을 정렬 합니다. 방울과 coverslip 반전 하 고 부드럽게 된 PSW 단계 4.1에서 추가 된 유리 자리 접시의 잘 위에 그것을 배치. 참고: PSW 우물에서 물방울 (그림 5)의 증발을 최소화 합니다. 4.1.4 4.1.1-단계에 따라 영상에 대 한 나머지 셀을 준비 합니다. 재생 셀 원하는 시간 분해능으로 현미경 이미지. 또는 재생 해 스테레오 현미경을 사용 하 여 관찰 합니다.참고: 재생 셀 절단 또는 자당 또는 요소와 치료 후 즉시 시작 됩니다. 그러나, 보이는 새로운 구강 구조는 중생의 시작 후 약 3 h를 형성할 것 이다. 각 시간 지점에 대 한 각 셀의 3 개의 재생 단계 중을 할당 합니다. 이렇게 하려면 (그림 4 및 그림 6) 단계를 설명 하는 대표 이미지를 각 셀을 비교 합니다. 1 단계는 membranellar 밴드 아직 (그림 6A)가 없는 셀에 할당 합니다. 2 단계 membranellar 밴드와 셀에 할당 합니다.참고: membranellar 밴드 (그림 4, 그림 6B) 치료 후 3-6 h에 나타납니다. 이 단계의 끝부분에 membranellar 밴드의 후부 끝의 추가 곡률 구두 primordium 나타납니다 하기 바로 전에 표시 됩니다. 3 단계 구강 primordium 셀에 할당 합니다.참고: 구두 primordium membranellar 밴드 (그림 4, 그림 6 c 6 d)의 후부 끝에 치료 후 6-8 h를 표시 하는 invagination입니다. 재생 세포는 그들의 앞쪽 끝과 특성 트럼펫 셀 모양 (그림 4, 그림 6E) membranellar 밴드 때 완료 됩니다. 대부분 Stentor 세포 재생의 시작부터 8-9 h 이내 완전히 재생성 됩니다. 각 스택된 상자 그림 (그림 7)의 형태로 각 시간 지점에 대 한 재생 단계에 있는 세포의 백분율을 플롯 합니다.참고:이 유형의 플롯 셀의 인구에서 재생 역학의 시각화 수 있습니다.