JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Diagonale Methode zur Maßnahme Synergie zwischen beliebig vieler Medikamente

Published: June 21, 2018
doi:
10.3791/57713
, , ,
1Faculty of Engineering and Natural Sciences,Sabanci University, 2Nanotechnology Research and Application Center,Sabanci University, 3Laboratory of Systems Pharmacology,Harvard Medical School

Summary

In diesem Protokoll beschreiben wir wie Sie Loewe Additivität basierende Medikament Interaktion Messungen paarweise für und Dreiwege Medikamenten-Kombinationen.

Abstract

Eine synergetische Wirkstoffkombination hat eine höhere Wirksamkeit im Vergleich zu den Auswirkungen der einzelnen Drogen. Schachbrett-Assays, wo Drogen in viele Dosen verbunden sind, können empfindliche Messung von Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten. Aber diese Assays sind teuer und nicht gut für die Messung der Interaktion zwischen den vielen Medikamenten skalieren. Mehrere neuere Studien berichteten Droge Interaktion Messungen mittels eine Diagonale Probenahme von den traditionellen Schachbrett-Assay. Diese alternative Methode erheblich verringert die Kosten der Droge Interaktion Experimente und ermöglicht Interaktion Messung für Kombinationen mit vielen Medikamenten. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der drei paarweisen Interaktionen und ein Dreiwege Interaktion zwischen drei Antibiotika in zweifacher Ausfertigung, in fünf Tagen, mit nur drei 96-Well-Mikroplatten und standard Laborgeräten. Wir präsentieren repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die drei-Antibiotikum-Kombination von Levofloxacin + Nalidixic Säure + Penicillin G synergistische ist. Unser Protokoll verkalkt, um Interaktionen zu viele Drogen und in anderen biologischen zusammenhängen ermöglicht effiziente Bildschirme für Multi-Drug Synergien gegen Krankheitserreger und Tumoren zu messen.

Introduction

Wirkstoffkombinationen können überraschend hohe oder niedrige Auswirkung auf einen Phänotyp angesichts der Auswirkungen der konstituierenden Drogen, entsprechend synergistisch oder antagonistisch Arzneimittelinteraktionen, bzw.1,2,3aufweisen. Synergistische Kombinationen können Dosissteigerung zur Erhöhung der Wirksamkeit und Dosisreduktion für Nebenwirkung Relief. Kombinationstherapien können auch mehrere Rückschläge auf zellulären Maschinerie, dadurch blockiert mögliche evolutionäre Fluchtmechanismen Widerstand4anwenden. Daher sind Kombinationen von drei oder mehr Medikamenten Krankheitserreger oder Krebs Behandlung5routinemäßig eingesetzt.

Synergie und Antagonismus werden durch einen Vergleich zwischen den beobachteten Effekt einer Kombination im Vergleich zu einem erwarteten Wirkung gegeben einzelnen Drogenwirkungen definiert. Unter den Modellen für Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten Loewe Additivität ist die strengste und hat ein klar definiertes null Modell ()Abbildung 1()6, und die abgeleitete Synergie/Antagonismus Interaktion ist unabhängig von der verwendeten Konzentration der Droge 6 , 7. Loewe Modell ist jedoch auch für einen paarweisen Wechselwirkung Test experimentell kostspielig. Droge Interaktion Assays bestehen traditionell aus einer 2D-Matrix Wirkstoffkombinationen Konzentration (ein Schachbrett-Assay) ()Abbildung 2(). Wenn 5 Dosen sind für jedes Medikament verwendet, dann 25 Kombinationen erforderlich sind, entspricht eine Hälfte einer Mikrotestplatte wenn Experimente in Wiederholung durchgeführt werden. Die Kosten für diesen Ansatz verbietet Synergie Messung vom Loewe Additivität Modell für Multi-Wirkstoffkombinationen ()Abbildung 3(). Zum Beispiel um eine 10-fach-Interaktion zu testen, müsste traditionelle Methoden mehr als 100 Tausend Mikroplatten, abgesehen von experimentellen Messung von höherwertigen Synergien durch das strenge, gut theoretisiert und Konzentration-unabhängige Loewe Additivität Modell 8.

Aktuelle klinische Behandlungen nutzen nur einen Bruchteil der möglichen Medikamenten-Kombinationen. Die standard-Behandlung von aktiver Tuberkulose ist beispielsweise eine Kombination aus drei Antibiotika. Es gibt etwa 20 Antibiotika in Mycobacterium Tuberculosis (Mtb) Behandlung verwendet. Es gibt 1140 3-Wege-Kombinationen unter 20 Medikamente, jeweils mit dem Potenzial, eine starke Synergie gegen Mtbhaben. Da gab es keine kostengünstige Methode zur Messung von Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten zu viele Drogen, bleiben potentiell lebensrettende synergistische Kombinationen ungetestet.

Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Messung der paarweisen und Dreiwege Arzneimittel-Wechselwirkungen durch Stichproben nur die Diagonale von einem Schachbrett-Assay ()Abbildung 4 und Abbildung 5(). Das zugrunde liegende Konzept der Probenahme die Diagonale von einem Schachbrett-Experiment wurde von Berenbaum in seiner bahnbrechenden Arbeit in 19789theoretisiert. Dieser Ansatz wurde jedoch erst vor kurzem auf Droge Synergie Bildschirme10,11,12angewendet. Wir präsentieren unser Protokoll mit Escherichia coli (E. Coli) und dem Wachstum Phänotyp. Wir beachten Sie jedoch, dass das Protokoll unabhängig von der biologischen Arten und Phänotyp von Interesse, und daher auf die Messung von höherwertigen Droge Synergie in anderen biologischen zusammenhängen angewendet werden kann.

Protocol

Hinweis: Jedes kleines Molekül, das Wachstum von E. Coli Bakterien hemmt die Diagonale Methode einsetzbar. In diesem Protokoll, Levofloxacin (LEV), wird Nalidixic Säure (NAL) und Penicillin G (PNG) als Beispiel verwendet, da diese Medikamente eine auffallende Dreiwege Synergie zeigen. Der Workflow dieses Protokolls wird als Abbildung 6dargestellt. Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur. Verwenden Sie frische Aliquote von Bakterien und Drogen jeden Tag. Führen Sie das Experiment unter Biosafety Niveaus geeignet für E. Coli. 1. vorbereitende Schritte Bereiten Sie Luria-Bertani (LB) Medien zu, indem Sie 1 L destilliertes Wasser 25 g LB Brühe hinzufügen und mischen. Autoklaven bei 121 ° C für 15 min und autoklaviert Medien bei Raumtemperatur lagern. Bereiten Sie E. Coli Glycerin Bestände durch Mischen gleiche Volumina von sterilen 50 % Glycerin und Bakterienzellen verdünnt auf OD600 = 1 in LB Brühe und Einfrieren 150 µL-Aliquots in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen bei-80 ° C. 20 mg Antibiotika, LEV, NAL und PNG in 1 mL jedes Dimethyl Sulfoxid (DMSO) auflösen. Verdünnen Sie LEV Lösung 100 X 0,2 µg/ml durch das Mischen von 10 µL LEV-Lösung mit 990 µL von DMSO. Verwenden Sie 0,2 mg/mL LEV und 20 mg/mL NAL und PNG in den Schritten fortfahren. Aliquoten 50 µL jedes Antibiotikum 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Einfrieren bei-20 ° C. Nehmen Sie eine 150 µL aliquoten von E. Coli von-80 ° C. Tauwetter. 100 µL der E. Coli -Glycerin-Lager in 5 mL LB Medien in einem 14 mL Kultur Rohr hinzufügen. Schütteln Sie die Rohre in einem Inkubator 37 ° C über Nacht bei 200 u/min. 2. serielle Verdünnung Dosis-Wirkungs-Experiment Nehmen Sie eine Aliquote Drogen LEV, NAL und PNG von-20 ° C, lassen Sie sie bei Raumtemperatur für 10 min Auftauen und bereiten für serielle Verdünnungen dieser Medikamente. Bereiten Sie 1100 µL LB – 10 % Sol durch das Mischen von 990 µL LB Medien und 110 µL des Lösungsmittels (DMSO). Bereiten Sie 500 µL LB – 10 % LEV durch das Mischen von 450 µL LB Medien und 50 µL der LEV. Vortex LB – 10 % Sol für 5 s bei der höchsten Einstellung. Die obersten vier Reihen von Brunnen in einer 96-Well-Mikrotestplatte 20 µL LB – 10 % Sol hinzufügen. Vortex LB – 10 % LEV für 5 s bei der höchsten Einstellung. Die erste Bohrung in Zeile A. 20 µL LB – 10 % LEV hinzufügen Wappnen Sie zweifach serielle Verdünnung für LB – 10 % LEV 20 µL aus dem ersten Brunnen, hinzufügen zum zweiten Brunnen, nach oben und unten fünfmal pipettieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Brunnen gegenüber dem Vorquartal bis 11. gut, endet mit 40 µL (Abb. 7A). Entfernen Sie und entsorgen Sie 20 µL des Inhalts vom 11. gut, mit einer Mikropipette. Wiederholen Sie die Schritte 2,3 bis 2,7 für die Drogen NAL und mit der zweiten und dritten Zeilen der Mikrotestplatte bzw. PNG. Wiederholen Sie die Schritte 2,3 bis 2,7 für das Medikament LEV am vierten Zeile wieder als interne positive Kontrolle. Mit einem Spektralphotometer messen die OD600 eine 01:10 Verdünnung der Kultur (Stufen 1,5-1,7). Verdünnen Sie die Zellen in 5 mL LB-Medien auf einem OD-600 von 0,01. Gießen Sie in ein Reservoir. Mit einem Mehrkanal-mikropipette, 80 µL der verdünnten Zellen fügen Sie hinzu, die Droge serielle Verdünnungen in Schritt 2,4-2,9 vorbereitet. Die Letzte Droge-Konzentrationen in jede Vertiefung ist in Abbildung 7Agezeigt. Versiegeln Sie die Platte, um Verdunstung zu verhindern. Inkubieren Sie die Platte für 16 h bei 37 ° c Starten Sie eine neue Bakterienkultur im Schritt 3 verwenden (wiederholen Sie Schritte 1,5-1,7). 3. lineare Verdünnung Dosis-Wirkungs-Experiment Messen Sie die OD600 Extinktion für serielle Verdünnung Dosis-Wirkungs-Platte aus Schritt 2 mit einem Teller Reader (Abbildung 7A Rechts) zu und interpretieren Sie der Ergebnisse anhand der folgenden Schritte. Normalisieren Sie das Wachstum zu, indem man das Wachstum in jedem Bohrloch mit dem Wachstum in der keine Doping-Kontrolle für jede Zeile und berechnen Sie Prozent Wachstum durch die Normalisierung der OD600bis kein Medikament Zustand zu. Suchen Sie für jedes Medikament die Brunnen, die Wachstumshemmung ~ 50 % (IC50) in Orange in Abbildung 7A richtigdargestellt haben. Weisen Sie die Konzentration in diesen Brunnen als “serielle IC50” für jedes Medikament. Tauen Sie frischen Droge Aliquote, bereiten Sie 1 mL LB – 10 % Sol durch Mischen LB Medien und Lösungsmittel (DMSO) in einem Verhältnis von 9:1 und LB – 10 % Droge durch Mischen von LB Medien und Droge im Verhältnis 9:1, wo die Wirkstoffkonzentration 100 X serielle IC50 jedes Medikament ist vor dem Hinzufügen der LB Medien , wie bei Schritt 3.3 gewählt. Bereiten Sie Linear steigende Dosen von Medikamenten LEV, NAL und PNG in 11 Konzentrationen durch Mischen LB – 10 % Drogen- und LB – 10 % Sol in Mengen, die in Abbildung 7gezeigt. Bereiten Sie Linear steigende Dosen von LEV am vierten Zeile als eine interne Positivkontrolle. Messen Sie die OD600 von der 01:10 Verdünnung der Kultur begann im Schritt 2.14. Verdünnen Sie die Zellen in 5 mL LB-Medien auf einem OD-600 von 0,01. Gießen Sie in ein Reservoir. Fügen Sie 80 µL der verdünnten Zellen auf die Droge lineare Verdünnungen im Schritt mit einem Mehrkanal-Mikropipette 3.6 vorbereitet. Die Letzte Droge-Konzentrationen in jede Vertiefung ist in Abbildung 7 bgezeigt.Hinweis: Die Mitte in der Dosis-Wirkungs-erhalten die serielle IC50 für dieses Medikament. Dichtplatte um Verdunstung zu verhindern. Inkubieren Sie die Platte für 16 h bei 37 ° c Starten Sie zwei frische Bakterienkulturen im Schritt 4 verwenden (wiederholen Sie Schritte 1,5-1,7). (4) Diagonale Drug Interaction Experiment Messen Sie die OD600 Extinktion für Dosis-Wirkungs-lineare Verdünnung von Schritt 3 (Abb. 7 b). Wählen Sie für jedes Medikament die Konzentration, die IC50 führte und bereiten Drogen LEV, NAL und PNG in 100 x IC50 Konzentrationen. Tauen Sie frische Drogen, bereiten Sie 100 x IC50 für jedes Medikament und bereiten Sie 1:1-Wirkstoff-Mischungen nach Volumen von LEV + NAL, LEV + PNG und NAL + PNG und 1:1:1 Medikament Mischung Volumenprozent LEV + NAL + PNG. Bereiten Sie zwei Platten auf Droge Interaktion Experimente wie in Abbildung 8dargestellt. Messen Sie die OD600 von der 01:10 Verdünnung der Kulturen im Schritt 3.11 begann. Bereiten Sie OD600 = 0,01 Verdünnungen zweier Kulturen in zwei 10 mL LB Medien. Fügen Sie 80 µL der Zellen von Kultur 1 und 2 auf Platten 1 und 2, beziehungsweise. Versiegeln Sie die Platten um Verdunstung zu verhindern. Inkubieren Sie die Platten für 16 h bei 37 ° c 5. Diagonale Drug Interaction Scores Maßnahme die OD600 Extinktion für Diagonale Wechselwirkungen experimentieren Platten aus Schritt 4. Das Wachstum zu normalisieren, indem man das Wachstum in jedem Bohrloch mit dem Wachstum keine Drogenkontrolle gut für jede Zeile. Suchen Sie für jede Zeile Spalte, die Wachstumshemmung am nächsten IC50, rechts in Orange in Abbildung 8 dargestellt hat. Ordnen Sie IC50 basierend auf die relative Konzentration des Medikaments in dieser gut zu. Für LEV + NAL, LEV + PNG und NAL + PNG und LEV + NAL + PNG Dosis-Reaktionen Berechnung erwartete IC50 durch Mittelung der IC50 der einzelnen Drogen in jeder Kombination. Beachten Sie, dass im Durchschnitt eine einfache Näherung für genaue erwartete IC50-Berechnung ist wie vor12beschrieben. Berechnen Sie gebrochene inhibitorischen Konzentration (FIC) punktet durch die Aufteilung der beobachteten IC50 durch den erwarteten IC50 in jeder Kombination.

Representative Results

Bisher haben wir die paarweisen Interaktionen zwischen drei Drogen berichtet: LEV, NAL und PNG basierend auf Tests in miniaturisierten Schachbrett-Assays, wo zwei Drogen wurden in einem 4 x 4-Matrix13,14kombiniert. NAL und LEV synergistische waren, wurde PNG berichtet, antagonistischen mit NAL und LEV13,14. Hier, wir überprüft diese paarweisen Interaktionen und die Dreiwege Interaktion zwischen diesen drei Medikamente mit einem diagonalen Assay gemessen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass LEV + NAL + PNG eine synergistische 3-Wege-Antibiotika-Kombination. Schematische Darstellungen für die Ergebnisse der einzelnen Versuchsdurchführung Abschnitte erhielten auf der rechten Seite von Abbildung 7 und Abbildung 8. Hier präsentieren wir und interpretieren repräsentative raw Ergebnisse aus drei Lesungen, Platte, die in Abbildung 9gegeben sind. Die obere Platte Lesung entspricht serielle und lineare Verdünnung Experimente in den Schritten 2 und 3. Die unteren zwei Teller Lesungen sind doppelte Interaktion Platten in Schritt 4 durchgeführt. Die Rohdaten in Abbildung 9 zeigt, dass Wachstum um 0,55, aber es eine 0,05 optische Dichte des Mediums selbst gibt, wie in der OD600 der hohen Wirkstoff-Konzentrationen beobachtet wo gibt es kein Wachstum. Daher definieren wir als IC50 (0.55-0.05)/2 = 0,25. Für jede Dosis-Wirkungs-sind die Brunnen befindet sich am nächsten an diesem Wert mit Orange angezeigt. Die obere Hälfte der Abbildung 9A zeigt die Ergebnisse aus Schritt 2, serielle Dosis-Wirkungs-Experiment. Die IC50 Wells für LEV ist in Spalte 10 in zwei Wiederholungen, die 4 ng/mL entsprechen. Die IC50 für NAL und PNG sind 3 µg/mL und 25 µg/mL, beziehungsweise. Diese Konzentrationen entsprechen 1 X-Konzentration, die in Abbildung 7gezeigt. Die untere Hälfte der Figur 9 zeigt die Ergebnisse aus Schritt 3, lineare Dosis-Wirkungs-Experimente. LEV, NAL und PNG IC50 befinden sich 0,4 x 0,8 x und 1.2 X, beziehungsweise. Diese Konzentrationen sind als 1 X IC50 für Schritt 4 zugewiesen. Zwei Platten entspricht zwei replizieren, die Versuche sind in Abbildung 9 b, wo die IC50 Brunnen gezeigt werden in Orange angezeigt. Ihre IC50 stehen alle einzelnen Drogen in Platte 1 1 X Konzentration. Die erwarteten IC50 für die paarweise oder Dreiwege Kombination errechnet sich durch das arithmetische Mittel der konstituierenden Drogen machen erwarteten IC50 für alle Kombinationen auch 1 X Konzentration. In Platte 2, LEV und PNG haben ihre IC50 bei 1 X Konzentration, aber NAL IC50 ist bei 1,2 X. Die erwarteten IC50 für jede Kombination wird über das arithmetische Mittel dieser IC50-Werte definiert. Beispielsweise ist die erwartete IC50 für LEV + NAL und NAL + PNG 1.1 X. Die Wechselwirkungen zwischen Medikamenten Punkten (FIC) für jede Kombination dividiert wird beobachtet IC50 mit der erwarteten IC50 wie auf der rechten Seite der Platten dargestellt. Inspektion der FIC Partituren der beiden Platten zeigt, dass LEV + NAL und LEV + NAL + PNG synergistische, während LEV + PNG und NAL + PNG feindselig sind. FIC Partituren erwarb die beiden Platten sind sich einig, die Zuverlässigkeit des Protokolls zu unterstützen. Abbildung 1: Null Modelldefinition für Loewe Additivität Medikament Interaktionsmodell. Zwei 5 x 5 Matrizen auf einer Mikrotestplatte Medikament A steigt linear in einer Achse, wie links gezeigt, wobei eine höchste Konzentration des Arzneimittels hemmt einen quantifizierbaren Phänotyp (oben rechts). Die Zugabe dieser Matrizen zeigt sich in der Mitte, wo die Verbindungslinien zwar Medikament Konzentrationen in jedes einzelne Medikament die gleiche Konzentration als Medikament A. haben Wenn Zellen auf diese “Schachbrett” Konzentration Wirkstoffkombinationen hinzugefügt werden, wird davon ausgegangen, dass der aufgezeichneten Phänotyp auf dieser Linie werden Äquivalent für die Brunnen, die sie verbindet. In diesem selbst-selbst-Droge Interaktion Experiment soll die Isobole Darstellung eines Phänotyps (mit einer grünen gestrichelten Linie dargestellt) linear, definieren die Additivität null Modell sein. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: paarweise Drogeinteraktionen nach Loewe Additivität Medikament Interaktionsmodell. Wenn zwei Medikamente in einem Schachbrettmuster Assay wie in Abbildung 1kombiniert werden, kann die beobachteten Isophenotypic Kontur gerade, konvex oder konkav sein. Auf der rechten Seite sind mögliche Isophenotypic Konturen (grün gestrichelt) Schachbrett Assays überlagert. Wirkstoffkombinationen mit geraden Isophenotypic Konturen sind Loewe-Additiv, da die Konturen nicht anders als eine selbst-selbst-Wechselwirkungen sind die Loewe-Additiv ist per Definition. Wenn die Isophenotypic Kontur deutlich konkav oder konvex ist, ist die Kombination synergistisch oder antagonistisch, beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Dreiwege Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten nach Loewe Additivität Medikament Interaktionsmodell. Ähnlich wie bei der Schachbrett-Assay für paarweisen Interaktionen, werden drei Drogen in einem 3D Raster (ein “Checkercube”), kombiniert, wo jedes Medikament in einer Achse linear erhöht wird. Wenn die drei Medikamente identisch wären, dürfte die Isophenotypic Oberfläche flach, definieren die Additivität für drei Wirkstoffkombinationen werden. Wenn die Oberfläche konkav oder konvex als dieses null Loewe-Additiv-Modell ist, sind Wirkstoffkombinationen synergistisch oder antagonistisch, beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: Diagonale Methode zur Messung der paarweisen Arzneimittelinteraktionen. Für jedes Schachbrett-Assay gemessen werden nur die Bereiche in Magenta Rechtecke dargestellt. i und Ii steigen linear einzigen Wirkstoff-Konzentrationen. III wird bewertet, indem er eine 1:1 Mischung von zwei Medikamenten und Linear titrieren diese Mischung, als sei es ein einzelnes Medikament. Der FIC ist gleich der beobachteten IC50 in der Kombination geteilt durch die erwarteten IC50 zwei einzelne Medikamente. Für die Loewe-Additivität-Modell wird die erwartete IC50 durch die durchschnittliche IC50 die beiden einzigen Medikamente angenähert. Ein FIC-Wert ist 1 für Loewe-Additiv-Paare und niedriger oder höher als 1 bei synergistisch oder antagonistisch Paaren, bzw.2,12. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5: Diagonale Methode zur Messung der Dreiwege Arzneimittelinteraktionen. Für jede Checkercube-Assay werden nur die abgebildeten Regionen gemessen. i, Ii und Iii steigen linear einzigen Wirkstoff-Konzentrationen. IV wird gemessen, indem man eine 1:1:1 Mischung aus drei Drogen und Linear titrieren diese Mischung, als wäre es ein einziges Medikament. Die gebrochene inhibitorischen Konzentration entspricht den beobachteten IC50 in der Kombination geteilt durch die erwarteten IC50 drei einzelne Medikamente gegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 6: Workflow für die Diagonale Methode Protokoll beschriebenen und Einrichtungsdetails für jedes Mikrotestplatte. Die Platte in Tag 4 dargestellte erfolgt in zweifacher Ausfertigung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 7: serielle und lineare Verdünnung Dosis-Wirkungs-Experimente. (A) Vorbereitung der Dosis-Wirkungs-serielle Verdünnung für ein Medikament und entsprechende endgültige Droge-Konzentrationen. E. Coli Zellen werden auf die Platte hinzugefügt; Wachstum wird aufgezeichnet, nachdem 16 h. serielle IC50, gezeigt in Orange, für jedes Medikament ausgewählt wurde, für Gebrauch in den folgenden Tag linear ist Verdünnung Dosis-Wirkungs-Experimente. (B) Vorbereitung der Dosis-Wirkungs-lineare Verdünnung für ein Medikament und entsprechende endgültige Droge-Konzentrationen. E. Coli Zellen werden auf die Platte hinzugefügt; Wachstum wird nach 16 Uhr aufgezeichnet. Für jedes Medikament Medikament die ausgewählten IC50s, die am nächsten Tag verwendet werden Interaktion, die Experimente in Orange angezeigt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 8: Drug Interaction Experimente. Vorbereitung der Interaktion Experimente ist ähnlich wie einzelne Droge lineare Dosis-Antworten, außer dass eine 1:1 oder 1:1:1 Mischung von Medikamenten dient für zwei oder drei Medikament Dosis-Antworten, beziehungsweise. IC50s für jede Dosis-Antwort, abgebildet in Orange, beobachtet werden verwendet, um FIC Ergebnisse berechnen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 9: Vertreter experimentieren Ergebnisse. Repräsentative Ergebnisse über das beschriebene Protokoll werden mit Angaben im Haupt-Text angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Die Verwendung von Medikamenten-Kombinationen gegen Krankheitserreger oder Tumoren ist eine attraktive Perspektive, besonders unter den Umständen der Trocknung Antibiotika Pipeline. Allerdings ist dieses Potenzial durch mindestens zwei Schwierigkeiten behindert. Die erste Schwierigkeit ist die astronomische Zahl der möglichen Kombinationen. Zum Beispiel gibt es 4950 paarweisen Kombinationsmöglichkeiten unter 100 Antibiotika. Alle möglichen Kombinationen unter 100 Antibiotika (2100) ist auf der gleichen Größenordnung mit der Anzahl der Bakterien auf der Erde (~ 10-30). Wie stark synergistische Kombinationen aus diesen Möglichkeiten vorhergesagt wurde Gegenstand zahlreicher rechnerische Untersuchungen. Die zweite Schwierigkeit ist die Messung der höchstwertige Arzneimittel-Wechselwirkungen. Der Auffassung, dass eine rechnerische Plattform darauf hindeuten könnte, dass eine bestimmte 10-Wirkstoff-Kombination gegen einen bestimmten Erreger stark synergistisch ist. Traditionelle Methoden, Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten zu testen ist zu teuer, zu überprüfen oder zu widerlegen diese Hypothese, daher wurde das Studium der Synergie zwischen viele Medikamente außerhalb der Grenzen der wissenschaftlichen Untersuchung. Die Diagonale Methode, die wurde vor fast 30 Jahren vorgeschlagen und wurde in den letzten Synergie-Bildschirmen verwendet bieten ein starkes Fundament für das erste Problem, indem es erlaubt, Prüfung von der Interaktion zwischen den vielen Paaren. Es löst das zweite Problem durch eine informative Probenahme von der traditionellen Assays und ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten höchstwertige.

Wir beachten wichtig ist, dass unser Protokoll eine lineare Dosierung für Droge Interaktion Messungen verwendet für die Empfindlichkeit zur Erkennung von gar schwachen Wechselwirkungen. Festlegung des richtigen Konzentrationsbereichs für lineare Dosierung ist eine anspruchsvolle Aufgabe. Durch die erste Durchführung eine serielle Verdünnung, machen wir eine fundierte Entscheidung über den Suchraum für lineare Dosierung. Aber das Protokoll kann geändert werden, um 2-fach verwenden oder höhere Verdünnungsreihen für Drogen-Interaktion zu testen. Eine solche Änderung würde das Experiment zu verkürzen und ermöglichen das Testen von mehr Interaktionen; Allerdings hätte es Sensibilität zu nur stark synergistische oder antagonistische Interaktionen zu erkennen.

Das Protokoll, die, das wir beschrieben, zeigt die Messung der paarweisen oder Dreiwege Interaktionen. Ein kritischer Aspekt des Protokolls ist, dass einzelne Agenten auf der gleichen Platte als Kombination, um Verzerrung aufgrund Platte Variationen zu minimieren. Daher kann das Protokoll angepasst werden um Interaktionen bis zu 7-Wege-Kombinationen zu messen durch triviale Änderungen. Kombinationen von mehr als 7 Medikamenten erfordert mehr als eine 96-Well Mikrotestplatte und weitere Überlegungen getroffen werden, um korrekte Datenintegration, wie zwischen den Platten Wiederholungen zu gewährleisten.

Eine nennenswerte Einschränkung der Diagonale Methode ist die Einschränkung, dass jedes Medikament in der Probe muss den Phänotyp von Interesse zu hemmen. Daher ist die Diagonale Methode nicht hilfreich für das Verständnis der Interaktionen zwischen den Wirkstoffen und inerte Adjuvantien. Solche “potenzierende” Wechselwirkungen können unter alternative Modelle wie Glückseligkeit oder höchsten Einzelsubstanz Modelle untersucht.

Ein wichtiger Aspekt für die Analyse von Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten höchstwertige eignet sich null Modell für “erwartet, die IC50.” Wenn zwei Medikamente kombiniert werden, kann die Kombination Wirkung nur auf die einzelnen Drogenwirkungen verglichen werden. Wenn drei Medikamenten kombiniert werden, kann die Kombination Wirkung auf die einzelnen paarweise Auswirkungen oder verglichen werden. Zum Beispiel wenn alle paarweise Kombinationen der drei Medikamente synergistische sind, dann es zu rechnen, dass diese Medikamente eine drei-Wege-Synergie zeigen werden. Eine drei-Wege-Interaktion Abweichung von paarweisen Interaktionen Erwartungen hat vor kurzem “emergent Interaktion”16,17genannt. Der Einfachheit halber beschreibt unser Protokoll die Messung der drei-Wege-Kombination “net Interaktion,” die null Modell als einziges Medikament Auswirkungen definiert. Die Daten, die von dem Protokoll vorliegt können jedoch auch verwendet werden, um die emergent Interaktion der drei-Wege-Kombination zu berechnen. In unserer Analyse haben wir die erwartete IC50 der Dreiwege Kombination als der Durchschnitt der einzelnen Droge IC50s definiert. Alternativ können die erwarteten IC50 als Durchschnitt der IC50s der paarweisen Kombinationen (~1.1-1.2) definiert werden. Wenn die beobachteten IC50 durch diese alternative erwarteten IC50 geteilt wird, bietet der erhaltenen FIC emergent FIC für die drei-Wege-Kombination als zuvor beschriebenen12. Diese Überlegung zeigt, dass LEV + NAL + PNG mehr ist als was man erwarten würde von paarweisen Interaktionen zwischen drei Medikamente, synergistische zeigt, dass LEV + NAL + PNG emergent Synergie hat.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von NIGMS Grant P50GM107618 finanziert. Die Autoren danken für die hilfreichen Kommentare und Anregungen zum Manuskript Zohar B. Weinstein.

Materials

1.5 mL Semi Micro Cuvette  VWR 97000-586
1.5 mL  Eppendorf Microcentrifuge Tubes USA Scientific 4036-3204
1000 µL Tips Geneseesci 24830
14 mL Breathable Cell Culture Tube VWR 60819-761
20 µL Tips Geneseesci 24804
200 µL Tips Geneseesci 24815
37 °C Incubator Panasonic MIR-262-PA
37 °C Shaker Incubator Thermo Scientific SHKE8000
5 mL Cell Culture Serological Pipette VWR 53300-421
96-well Microplates VWR 15705-066
Breathable Sealing Film USA Scientific 2920-0010
DMSO Sigma 41647
Escherichia coli ATCC 700926
Glycerol Sigma G9012
LB Broth Powder RPI L24065
Levofloxacin Sigma 28266
Micropipette GILSON PIPETMAN Classic
Microplate reader BioTek Synergy H1
Multichannel micropipette VistaLab 1060
Nalidixic acid Sigma N8878
Penicillin G Sigma P3032
Pipette Pump Drummond  4-000-501
Reagent Reservoir VWR 89094-658
Spectrophotometer BIO-RAD 1702525
Vortex Mixer Fisher Scientific 10-320-807
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts. Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).
  2. Berenbaum, M. C. What is synergy?. Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).
  3. Cokol, M. Drugs and their interactions. Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).
  4. Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance. Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).
  5. Lehár, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. High-order combination effects and biological robustness. Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).
  6. Loewe, S. The problem of synergism and antagonism of combined drugs. Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).
  7. Foucquier, J., Guedj, M. Analysis of drug combinations: current methodological landscape. Pharmacology Research & Perspectives. 3 (3), (2015).
  8. Wood, K. B. Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).
  9. Berenbaum, M. C. A method for testing for synergy with any number of agents. Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).
  10. Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis. Scientific Reports. 7, 42644 (2017).
  11. Horn, T., et al. High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells. Krebsforschung. 76 (23), 6950-6963 (2016).
  12. Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis. Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).
  13. Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).
  14. Mason, D. J., et al. Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).
  15. Yilancioglu, K., et al. Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity. Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).
  16. Beppler, C., et al. Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors. Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).
  17. Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs. Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).

Tags

Diagonal MethodSynergyMultiple DrugsSystems BiologyAntibiotic AliquotsBacterial CultureSerial DilutionsLB MediaDMSOLEVNALPNGOD600Dose-response ExperimentIC50

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Cokol-Cakmak, M., Bakan, F., Cetiner, S., Cokol, M. Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs. J. Vis. Exp. (136), e57713, doi:10.3791/57713 (2018).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image