Summary

Avaliação da viabilidade de um consórcio bacteriano sintético na Interface Host-micróbio em Vitro Gut

Published: July 04, 2018
doi:

Summary

Interações do anfitrião-micróbio de intestino foram avaliadas usando uma nova abordagem que combina uma comunidade oral sintética, em vitro digestão gastrointestinal e um modelo do epitélio do intestino delgado. Apresentamos um método que pode ser adaptado para avaliar a invasão celular dos micróbios patogénicos e biofilmes de várias espécies, ou mesmo para testar a capacidade de sobrevivência dos probióticos formulações.

Abstract

A interação entre o host e microbiota tem sido reconhecida por muito tempo e extensivamente descrita. A boca é semelhante a outras seções do tracto gastrointestinal, como microbiota residente ocorre e evita a colonização por bactérias exógenas. Com efeito, mais de 600 espécies de bactérias são encontradas na cavidade oral, e um único indivíduo pode transportar cerca de 100 diferentes a qualquer momento. Bactérias orais possuem a capacidade de aderir aos diversos nichos do ecossistema oral, assim, tornando-se integrados dentro dos residentes das comunidades microbianas e favorecem crescimento e sobrevivência. No entanto, o fluxo de bactérias no intestino durante a deglutição tem sido proposto para perturbar o equilíbrio da microbiota do intestino. Na verdade, a administração oral de p. gingivalis mudou a composição bacteriana na microflora ileal. Éramos uma comunidade sintética como uma representação simplificada do ecossistema natural oral, para elucidar a sobrevivência e viabilidade de bactérias orais, sujeitado a condições de trânsito gastrointestinal simulado. Catorze espécies foram selecionados, submetidos a em vitro salivar, gástrica e processos de digestão intestinal e apresentou um modelo de célula multicompartment contendo células Caco-2 e HT29-MTX para simular o epitélio da mucosa do intestino. Este modelo serviu para desvendar o impacto das bactérias engolidos em células envolvidas na circulação entero-hepática. Usar comunidades sintéticas permite a controlabilidade e reprodutibilidade. Assim, esta metodologia pode ser adaptada para avaliar a viabilidade do agente patogénico e inflamação associada as alterações subsequentes, capacidade de colonização de probiótico misturas, e em última análise, bacteriana potencial impacto sobre a circulação pré-sistêmico.

Introduction

Os seres humanos convivem com as bactérias, que estão presentes no mesmo número de células humanas1. Portanto, é de crucial importante obter uma compreensão abrangente da microbiome humano. A cavidade oral é um ambiente único, em que é dividido em vários habitats menores, assim, que contém uma grande variedade de bactérias e biofilmes nesses locais diferentes. Um ecossistema aberto, algumas espécies na boca podem ser transitórios visitantes. No entanto, certos microorganismos colonizam logo após o nascimento e a forma organizaram de biofilmes2. Estes são encontrados na superfície de dentes acima a fenda gengival, o bico subgengival, língua, mucosas e próteses dentárias e recheios3. Bactérias podem também estar presentes como flocos e células planctônicas no lúmen do canal do dente, ou misturado com o tecido pulpar necrótico ou suspensas em uma fluido fase.

Não há ativo, contínuo-conversas cruzadas entre células hospedeiras e a microbiota residente4. Bactérias se comunicar dentro e entre espécies, e apenas uma pequena proporção dos colonizadores naturais pode aderir aos tecidos, enquanto outras bactérias anexar a estes colonizadores primários. Por exemplo, ligação de celular entre microorganismos é chave para a integração de colonizadores secundários em biofilmes orais e construção de redes complexas de interação de células microbianas4. Cerca de 70% dos agregados de bactérias em uma amostra de saliva são formadas por Porphyromonas SP., Streptococcus SP., Prevotella SP., Veillonella SP. e não identificado Bacteroidetes. F. nucleatum é um colonizador intermediário no biofilme subgengival e agregados com os colonizadores tarde p. gingivalis, T. denticola e Tannerella forsythia, que estão implicados na periodontite5. Além disso, Streptococcus mitis ocupa habitats da mucosa e dentais, enquanto S. sanguinis e S. gordonii preferem colonizam dentes3. Assim, S. sanguinis está presente em menor incisivos e caninos, enquanto Actinomyces naeslundii foi encontrado em VITAPAN superior6.

Além disso, o indígena microbiome desempenha um papel na manutenção da saúde humana2. Microbiota residente participa educação imune e na prevenção da expansão do patógeno. Esta resistência de colonização ocorre porque as bactérias nativas podem estar melhor adaptado ao anexar às superfícies e mais eficiente em metabolizar os nutrientes disponíveis para o crescimento. Embora cepas probióticas sobrevivem a passagem gastrointestinal e permanecem ativas, a persistência de bactérias autóctones engolida de uma posição superior do trato gastrintestinal não foi totalmente descrita. Assim, estamos sujeitos a uma comunidade artificial, representante do ecossistema oral, às condições de trânsito gastrointestinal simulado. Viabilidade das células bacterianas foi avaliada usando um modelo multicompartment parecido com o epitélio do intestino. Simuladores de intestino atual oferecem reprodutibilidade adequada em termos de análise da comunidade microbiana luminal7. No entanto, adesão bacteriana e interação do anfitrião-micróbio separadamente destinam-se, como combinar linhas celulares com comunidades microbianas é um desafio8. Em contrapartida, apresentamos um quadro que apresenta potencial explicação mecanicista de colonização bem sucedidos eventos relatados na interface do intestino. Com efeito, este modelo pode ser usado em conjunto com um modelo de intestino estático para avaliar o impacto das comunidades microbianas na sinalização superfície do hospedeiro.

Protocol

1. cepas e as condições de cultura Nota: A Comunidade oral sintética foi composta por cepas comumente presentes no microbiome oral3. Obter as seguintes estirpes de coleção de cultura do tipo americano (ATCC): Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus…

Representative Results

Este protocolo leva à geração de um modelo apropriado para elucidar a sobrevivência e viabilidade de bactérias orais, sujeitado a condições de trânsito gastrointestinal simulado. As contagens de células intactas de cepas individuais é aproximadamente 108 células antes da mL-1 a criação da Comunidade sintética, enquanto o microcosmo terminousua contida acima de 90% de células viáveis durante o estabelecimento da Comunidade ( Figura…

Discussion

A microbiome oral é um elemento chave na saúde humana, como recentemente relatado por vários autores20,21. Conclusões anteriores sugerem que a ingestão de saliva contendo grandes cargas de bactérias pode influenciar o ecossistema microbiano do intestino delgado, que é um dos principais locais para a ferragem imune. A combinação de um modelo estático digestão gastrointestinal superior com a interface de host, representado pelas células epiteliais e sec…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem com gratidão apoio financeiro da Fundação de pesquisa de Flandres para Marta Calatayud Arroyo (FWO postdoctoral fellowship-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria é um pós-doutorado apoiado por Flandres inovação e empreendedorismo (Agentschap voor Innovatie porta Wetenschap en Technologie, navegação fluvial).

Materials

STRAINS
Aggregatibacter actinomycetemcomitans American Type Culture Collection ATCC 43718
Fusobacterium nucleatum American Type Culture Collection ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis American Type Culture Collection ATCC 33277
Prevotella intermedia American Type Culture Collection ATCC 25611
Streptococcus mutans American Type Culture Collection ATCC 25175
Streptococcus sobrinus American Type Culture Collection ATCC 33478
Actinomyces viscosus American Type Culture Collection ATCC 15987
Streptococcus salivarius  TOVE-R
Streptococcus mitis American Type Culture Collection ATCC 49456
Streptococcus sanguinis BCCM/LMG Bacteria Collection LMG 14657
Veillonella parvula Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM 2007
Streptococcus gordonii American Type Culture Collection ATCC 49818
CELL LINES
Caco-2 cells European Collection of Authenticated Cell Cultures 86010202
HT29-MTX cells European Collection of Authenticated Cell Cultures 12040401
REAGENTS AND CONSUMABLES
Brain Heart Infusion (BHI) broth Oxoid CM1135
Blood Agar 2 Oxoid CM0055 Blood Agar medium
Menadione Sigma M9429
Hemin Sigma H9039
5% sterile defibrinated horse blood E&O Laboratories Ltd, P030
InnuPREP PCRpure Kit Analytik Jena 845-KS-5010250 PCR purification kit
Big Dye Applied Biosystems 4337454 Dye for sequencing
ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit Applied Biosystems 4337456
SYBR Green I Invitrogen S7585
Propidium Iodide Invitrogen P1304MP
T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile VWR 734-2311
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924-100ML
Trypan Blue solution
0.4%, liquid, sterile-filtered
Sigma-Aldrich T8154 
PBS Gibco 14190250
DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate Life technologies 31966-047
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts Sigma-Aldrich CLS3450-24EA
Mucin from porcine stomach Type II   Sigma-Aldrich M2378
Inactivated fetal bovine serum Greiner Bio One 758093
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240062
Triton X 100 for molecular biology Sigma-Aldrich T8787 
DPBS without calcium, magnesium Gibco 14190-250
Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit Thermo Fisher Scientific 88953
Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm Corning Costar Corp 3450
Nuclease-free water Serva Electrophoresis 28539010
EQUIPMENT
Neubauer counting chamber improved Carl Roth T729.1
BD Accuri C6 Flow cytometer BD Biosciences 653118
PowerLyzer 24 Homogenizer MoBio 13155
T100 Thermal Cycler BioRad 186-1096
Flush system Custom made
InnOva 4080 Incubator Shaker New Brunswick Scientific 8261-30-1007 Shaker for 2.10
Memmert CO2 incubator Memmert GmbH & Co. ICO150med
Millicell ERS (Electrical Resistance System) EMD Millipore, Merck KGaA MERS00002
Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system Millipore, Merck KGaA
Shaker (ROCKER 3D basic) IKA 4000000 Shaker for 6.10

Referenzen

  1. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533 (2016).
  2. Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
  3. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
  4. Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
  5. Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
  6. Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
  7. Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
  8. Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133 (2014).
  9. Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
  10. Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
  11. Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235 (2017).
  12. Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
  13. Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340 (2018).
  14. Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
  15. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
  16. Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
  17. Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food – an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
  18. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
  19. Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
  20. Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
  21. Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
  22. Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307 (2015).
  23. Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
  24. Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
  25. Kleiveland, C. R., et al., Verhoeckx, K., et al. . The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 197-205 (2015).
  26. Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
  27. Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
  28. Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).

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Diesen Artikel zitieren
Calatayud Arroyo, M., Van de Wiele, T., Hernandez-Sanabria, E. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (137), e57699, doi:10.3791/57699 (2018).

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