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Umwelt

婆罗洲 "爆炸蚂蚁" (蚁科昆虫) 对下颌腺储层含量的分离--gc-ms 和 MetaboliteDetector Volatilome 分析

Published: August 26, 2018
doi:
10.3791/57652
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1Center for Analytical Chemistry, Department of Agrobiotechnology (IFA-Tulln),University of Natural Resources and Life Sciences Vienna (BOKU), Austria, 2Institute of Chemical, Environmental and Biological Engineering,TU Vienna, Austria, 3Department of Computational Biology of Infection Research,Helmholtz Centre for Infection Research, Germany, 4Institute for Biochemistry, Biotechnology and Bioinformatics,University of Technology (TU) Braunschweig, Germany, 52nd Zoological Department,Natural History Museum Vienna, Austria, 6Chemical Sciences,Universiti Brunei Darussalam, Brunei, 7Environmental and Life Sciences,Universiti Brunei Darussalam, Brunei

Summary

对蚂蚁Colobopsis explodens的小工人进行了解剖, 以分离出其肥厚下颌腺储层中储存的蜡样含量, 用于后续溶剂萃取和气相色谱-质谱分析。本文还介绍了利用开源软件 MetaboliteDetector 对挥发性成分进行标注和识别的方法。

Abstract

本手稿的目的是提出一个协议描述的 metabolomic 分析婆罗洲 ‘ 爆炸蚂蚁 ‘ 属于Colobopsis 丝瓜(COCY) 组。为此, 使用了模型物种C. explodens .属于小工人种姓的蚂蚁拥有独特的肥厚下颌腺体。在领土作战中, 他们利用其扩大的下颌腺储层 (MGRs) 的粘性含量, 以胃外壳 (autothysis) 自愿破裂的特点自杀性 “爆炸” 杀死对手节肢动物。我们展示了这一物种的工人蚂蚁的解剖, 以隔离蜡样的经理的内容的胃部分, 并列出了溶剂萃取所需的必要步骤, 其中含有挥发性化合物与随后的气体色谱-质谱 (gc-ms) 分析和所含代谢物的推定鉴定。解剖程序是在冷却条件下进行的, 不使用任何解剖缓冲液来最小化经理含量的化学成分的变化。在溶剂基萃取挥发性代谢产物后, 提出了用液-注-气相色谱法分析样品的必要步骤。最后, 给出了使用开源软件 MetaboliteDetector 的数据处理和假定的代谢产物识别。利用这种方法, 通过 GC-MS 和 MetaboliteDetector 软件, 对属于 COCY 组的蚂蚁 MGRs 中挥发性代谢物的分析和鉴定成为可能。

Introduction

该工作流的总体目标是对昆虫分泌物中化学成分的一般调查。这样做的主要目的是阐明整个分泌物的生态作用, 或其单一的化合物。此外, 我们有兴趣调查的代谢途径的化合物在各自的分泌物中发现。特别是来自蚂蚁的腺体 (膜翅目, 蚁科昆虫) 在过去的几年中获得了越来越浓厚的兴趣, 因为它们提供了迄今尚未开发的潜在生物活性化合物 (胶水, 抗菌剂等) 的来源1,2. 属于 COCY 组3、4的一些种类的小工人蚂蚁可提供其肥厚 MGRs 中所含的化合物, 从口器延伸到胃5、6。当被假定的敌人威胁时, C. explodens7 的小工人和一些相关物种可以以一种不寻常的方式利用他们的经理的内容: 他们牺牲自己的胃墙, 以弹出粘稠的内容MGRs 爆炸对对手, 因此被假定的敌人被扣留, 并且可能甚而死5,6,8,9。本文提出的方法的发展和使用的目的是帮助提高对这种蚂蚁分泌物的化学成分和初步毒性成分的认识。

为此, 我们提出了一个explodens工人蚂蚁解剖的协议, 以获得其蜡样的经理内容的胃部分, 随后的溶剂萃取和分析的 GC-MS。

gc-ms 分析是昆虫挥发性代谢物 (volatilome) 分析和鉴定的一种成熟方法。对蚂蚁感兴趣的典型分析物包括表皮碳氢化合物10、信息化合物11和一般的生物活性12的化合物。样品可以获得从整个动物或从身体部位和液体分离通过解剖昆虫13,14。样品制备技术包括用溶剂14或顶空固相微萃取 (HS 微萃取)15提取其中含有的代谢产物。

对 metabolomic 研究来说, 样品在取样后快速冷冻是非常重要的, 以便尽量减少化合物的化学成分和数量的变化。用于这项研究的蚂蚁死于快速冰冻的现场, 在一个冷藏袋里塞满了冰冻的冷藏包。这些样品然后被存放在一个-20 °c 冰箱使用发电机驱动的电力, 之前, 他们被送往实验室的干冰。这里提出的解剖程序提供了一种可能性, 以孤立的经理的内容, 而不分析整个蚂蚁或胃作为一个整体, 因为它已经做了之前为不同的 COCY 物种16,17,18。此外, 所提出的议定书还可以直接访问和分析周围的腺体和组织, 如毒液腺体 (VG)5,8, 杜福尔的腺体 (DG)8, 或肠道在其他生物研究, 或检查在处理或解剖蚂蚁过程中可能出现的交叉污染物。为了尽量减少在解剖过程中的经理内容的化学成分的变化, 无论是通过解冻样品或使用化学物质, 解剖工艺优化, 以在冷包 (-20 °c) 进行, 而不使用任何额外的缓冲,洗涤溶液或溶剂。通过该方法获得的样品适合于回答定性和定量的问题。

通过开放源码软件 MetaboliteDetector19, 为基于 GC-MS 的新陈代谢数据的自动分析, 建立了用于假定代谢物标注和识别的数据分析方法。它检测图谱中存在的单离子峰, 执行反褶积步骤, 并提取分析样品中所含化合物的 deconvoluted 质谱。根据确定的保留指数 (ri; Kovats 可由软件自动计算) 和 deconvoluted 质谱的相似性, 假定 MetaboliteDetector 化合物的识别。RI 和频谱匹配因子可以对现有的参考库 (如果它们是在通用 NIST 格式中) 或针对已建立的内部库进行交叉检查。这是根据建议的 (假定的) 复合识别准则,例如, 由新陈代谢标准倡议 (MSI) 的化学分析工作组 (CAWG), 其中至少有两个独立和正交数据相对于一个真实的化合物 (这里保留时间 (RT)/RI 和质谱) 分析在相同的实验条件下, 以确认非新的代谢物鉴定20。

对 COCY 型explodens的经理含量进行了完整的实验, 但解剖步骤也可以用来隔离蚂蚁胃中的其它腺体。此外, 虽然我们提出了一个综合分析经理内容 volatilome 的协议, 但描述抽取、GC-MS 测量和数据评估的工作流中更通用的部分也可以用于分析和 (假定)一般的挥发性代谢物的鉴定。

由于这篇手稿中所描述的实验是对昆虫进行的, 所以不需要道德上的认可。实地工作、蚂蚁抽样以及它们的出版使用都符合通过马来西亚文莱达鲁萨兰国、文莱研究和创新中心和文莱林业部 (文莱) 管理这个项目的指导方针。达鲁萨兰国.

Protocol

1. 蚂蚁的收集 收集小工人蚂蚁使用的吸引 (图 1)。 取样后, 立即将蚂蚁固定在-20 摄氏度, 并将其储存在这个或更低的温度, 直到分析。 2. 从蚂蚁中分离出经理的内容和 DG 在蚂蚁解剖之前, 准备以下内容: 使用甲醇-水混合物 (甲醇2O; 1 + 1 v/v) 和组织, 清洁玻璃培养皿和解剖仪器。注意: 甲醇对人类是有毒的。总是穿着适当的手套, 实验室大衣, 护目镜, 并在通风罩下进行清洁。 将冷包和玻璃培养皿冷冻到-20 摄氏度。 确定1.5 毫升短螺纹瓶的质量, 包括带有硅胶/聚四氟乙烯 (PTFE) 隔膜的螺钉帽, 并将它们放在显微镜旁边的冰上。注: 样品瓶的选择是可选的。在这里, 经理的内容被直接放入冷却1.5 毫升玻璃制成的瓶子。塑料可以含有可能导致工件的化合物 (如邻苯二甲酸酯), 这会干扰目标代谢物的信号。 将冷冻冷包放入一个由挤出聚苯乙烯泡沫制成的盒子里。将培养皿放在冷包的顶部, 将一只冰冻的蚂蚁放入盘子中。在立体显微镜下安装这个盒子。调整放大倍数 (20–40X) 和焦点, 直到整个蚂蚁可以清楚地看到。 检查冷冻蚂蚁的胃舱的完整性。对于解剖, 只带一个完整的胃区域的蚂蚁 (图 2A, B)。排除蚂蚁与扁平 gasters 或痕迹的硬化经理的内容在他们的身体表面从进一步分析 (图 2C, D)。 在 propodeum (第一腹段) 和另一对钳在叶柄 (第二腹段) 上抓住选定的蚂蚁与一对细尖钳。通过轻轻地把它从蚂蚁身体的其余部分中抽出来分离胃区域 (图 3A)。 修复现在分离的蚂蚁胃, 用细尖钳在 tergite 4 举行。另一对细尖钳抓 tergite 1 (位于叶柄旁边), 并轻轻地删除它剥离它 (图 3B)。重复这也为 tergites 2 和 3 (图 3C, D) 直到 MGRs 的胃部分 (黄色色在C. explodens工作者蚂蚁, 但镁内容的颜色可以范围从白色在黄色到红色在其他种类) 是可看见的最部分。注意: 除去外骨骼, 经理的细胞膜也将被部分去除。 通过使用解剖针, 轻轻地删除配对 MGRs 的蜡样的内容, 把它们从胃的车厢里划掉 (图 3E)。只删除可以隔离的经理内容的那些部分, 而不会使蚂蚁胃中的其他腺体破裂。如果需要更多的力量或努力来获得经理的内容作为一个整体, 接受它不完整的删除 (图 4)。 拿起经理的内容, 通过轻轻地触摸他们与解剖针的尖端, 直到他们坚持到它。然后将经理的内容转移到一个冷却的1.5 短螺纹小瓶与已知的包装质量。 要从解剖针的尖端移除粘性的经理内容, 请将针尖移到样品瓶的壁上, 然后将其涂抹到墙上。关闭瓶子, 把它放在冰上, 直到下一个经理的内容被隔离。 为了以后检查经理的内容样品可能的交叉污染由来自毗邻 DG 的化合物 (第 6), 也收集从蚂蚁, 它们仍然完好无损 (图 4), 并把它们放入一个单独的 HPLC 瓶。 总清洁培养皿和解剖仪器与甲醇/小时2O (1 + 1 v/v), 当改变从腺体到腺体或从蚂蚁到蚂蚁。 对于一个分析样本, 结合多个蚂蚁的储层内容或腺体。注: 用于一个分析样本的腺体数量或其内容可能因实验设计而异。在这里, 五只蚂蚁的经理的内容或分布式, 以获得一个分析样本。 3. 溶剂萃取分离腺体的含量 确定分析样品的质量 (这里, 经理的内容或邻近的腺体汇集从五蚂蚁)。 在1:14 瓦特/v 的恒定比下加入冰冷高纯度乙酸乙酯 (EtOAc), 在冷却条件下将样品进行涡流5分钟;这里, 在自动温控实验室的7摄氏度进行。 离心样品10分钟在 3820 x g 在7°c 和转移上清液 (大约55–75µL 为经理内容提取从五个蚂蚁) 入预冷1.5 毫升短螺纹小瓶包含0.1 毫升微型插入物。将装有孔和红色橡胶/聚四氟乙烯隔膜的螺钉盖紧密密封在瓶子上。注: 如果分析不能立即进行, 请将提取物保持在-80 摄氏度直到分析, 但建议在准备后立即对样品进行分析, 以尽量减少在冻结/解冻周期中发生化学变化的风险。 4. GC-MS 对于一个完整的 GC-MS 测量序列, 准备以下解决方案, 每一个1.5 毫升短螺纹瓶: 通过稀释商业上可用的烷烃标准溶液, 用己烷将每种化合物的8毫克/升的最终浓度, 准备一个 RI calibrant 混合物。 准备一个由纯 EtOAc 组成的溶剂空白。 将含有 1) 溶剂空白, 2) RI calibrant 混合物, 3) 经理含量提取物和 4) DG 含量提取物放在 autosampler 耦合到气相色谱仪 (GC) 的冷却托盘 (10 °c) 中。注: 建议在测量前尽量减少每瓶在 autosampler 中保存的时间跨度。对于关键的样品, 如经理的内容样本, 瓶子可能会放在 autosampler, 然后再分析。 对于每个样本, 将1µL 整除注入 GC-MS, 用于在适合于目标化合物的柱上进行色谱分离 (此处为: HP-5MS UI 列)。 设置适当的 GC 参数, 其外观可能如下所示: 以氦为载体气体, 设置恒定柱流1毫升/分. 设置烤箱温度坡道从40°c 开始与举行为2分钟, 跟随由10°c 的舷梯/分钟由330°c, 以保持时间7分钟. 将入口温度设置为270°C。 选择, 如果需要, 调整气相色谱-MS 注入的分裂比率, 使感兴趣的化合物达到足够的峰值形状和强度 (图 5)。注: 在所提出的例子中, 有必要测量的 DG 提取物的分裂率为2:1 和 RI calibrant 混合物在分流进样模式。对经理的内容提取物进行了分2:1 和第二次50:1 的分离分析。 将辅助温度设置为350摄氏度。 设置质谱仪 (ms) 的参数如下: ms 源温度230°c, ms 四温150°c, 扫描范围从低质量30到高质量 500, 溶剂延迟4.1 分钟 (为溶剂空白和实验样品) 或6.1 分钟 (为 RI calibrant 混合物)分别。将扫描速率设置为大约3扫描/秒。注: ms 参数, 特别是 ms 扫描-, 采样率和周期时间可能影响峰值采摘和频谱反褶积, 必须考虑当选择参数设置, 以适当的数据评估与 MetaboliteDetector 软件。 测量完成后, 将数据导出为。AIA 项目文件 (此处使用与 GC 一起交付的数据分析软件) 在便携式数据存储设备上执行。 选择文件 |将数据导出到 AIA 格式…, 然后检查 “创建新目录” 并单击”确定”。选择所需的存储位置 (例如, USB 闪存驱动器), 然后单击 “打开”。选择要导出的文件, 然后点击—>图标。使用单击过程确认。 5. 代谢产物的检测和识别与 MetaboliteDetector 软件的使用 在开始分析数据文件之前, 打开 MetaboliteDetector, 选择工具 |设置, 并按如下所示设置所需参数 (MetaboliteDetector 的各个工作表用粗体表示): 在工作表外观中, 将时间刻度设置为 “最小” 并启用 “坐标轴标签” 选项。 在工作表反褶积中, 将峰值设置的参数设置为: 峰值阈值:10, 最小峰值高度 (噪音单位):10。取消选择基线调整的启用。将代谢物检测的参数设置为: 箱/扫描:10、卷积宽度 (扫描): 5、所需强度 (基数峰值的%): 0 和所需的峰值数:10。 在工作表标识中, 将库搜索选项设置为: 复合 Lib: “CalibrationLibrary_Alkanes” 和 nist (nist sqlite 库可以包含在. lbr 格式中)。按如下方式设置参数: 最大值。RI 差异:10, 截止评分: 0.9, 纯/不纯成分: 0.5, 片段数: 2, 相同碎片的最小数目.: 1. 使用缩放的 lib: 打勾;相似性评分: 规范相似性;质量过滤器: m/z 207, 221, 281, 355 和 1147 (对于已知的污染物产生的气相色谱柱固定相)。 在板材定量设置参量到: 定量离子的数量: 3, 以后离子的极小的距离: 5, 并且极小的要求的质量索引: 1. 排除量化离子207、221、281、355和1147。注: 在高分辨率 MS 数据的情况下, 另外在工作表质心中设置以下参数: 峰值阈值开始:10, 峰值阈值结束:-5, 最大基线距离:30, FWHM: 0.5。 导入中的文件。CDF 格式包含在生成的。AIA 项目文件。通过选择文件 NetCDF 进入 MetaboliteDetector 软件|进口 |NetCDF 导入。选择文件夹形状的图标, 然后选择要导入和处理的样本类别的文件: 1) 溶剂空白, 2) RI calibrants, 3) 经理内容提取, 和 4) DG 内容提取。确认以OK开始数据处理。处理后, 在出现的窗口中选择 “关闭”。 用于 ri 校准和确定经理提取物中所含化合物的 ri 值, 请选择 “文件” | “打开并选择包含 RI calibrants 数据的文件。 打开 RI calibrant 文件后, 选择放大镜图标。确认出现的窗口, OK。 为了正确的 ri 校准, 检查在 ri calibrant 文件中可检测烷烃的范围。 为此, 选择出现在第一个峰值的最大值下面的三角形, 其起源于第一个烷烃 (最低 RT,图 6), 点击一次即可检测到它。 与烷烃库条目 (图 6) 相比, 以最高频谱相似度 (“sim”, 最大评分 = 1) 检查命中。 为了验证所建议的烷烃化合物的特性, 将其质量谱与文献中所给出的质谱进行比较,如NIST 化学 WebBook22。 通过计算色谱中出现的最后一个烷烃峰值, 确定 RI calibrant 混合物中最后的烷烃。 有关 RI 校准, 请选择工具 |RI 校准向导。选择下一步。 单击文件夹形状的图标, 然后选择包含 RI calibrant 混合物色谱的文件。选择下一步。 在出现的窗口中, 选择包含烷烃 calibrants 条目的库。 选择在 RI calibrant 文件中检测到的所有烷烃的库条目, 然后单击> >图标。选择> >后, 选择下一步。 检查出现的表中每个可检测到的烷烃所列的 RTs。为此, 请单击相应的三角形 (图 7), 检查每个烷烃在主窗口中描述的 RTs。如有必要 (图 8), 请通过双击相应字段, 选择下拉菜单, 并选择正确建议的 rt, 手动更正校准表中的 rt. 或者, 在键盘的帮助下键入 rt (图 9)。 当每个烷烃的 RT 是正确的, 选择下一步。在显示 RI 校准表的显示窗口中单击 “下一步”。 在出现的色谱选择窗口中选择绿色+符号, 选择溶剂空白的数据文件和腺体提取文件, 然后选择下一步。在显示窗口中设置参数设置, 如下所示: 禁用基线调整, 峰值阈值: 5, 最小峰值高度: 5, 箱/扫描:10, 卷积宽度: 5. 点击下一个然后开始执行 RI 计算所选示例文件中包含的化合物。 要在经理提取物中选择的代谢产物的注释和识别, 请打开被测量的经理内容提取物的数据文件, 根据上面的描述 (步骤 5.3.9) 来计算 RIs, 方法是选择文件 |打开并选择所需的数据文件。 选择工具 |设置 |反褶积和改变峰值阈值以及最小峰值高度 (噪声单位) 5。选择放大镜图标并再次确认出现的警告窗口, OK。 点击到一个三角形出现在最大的兴趣高峰, 并比较其质量频谱与那些存储在 nist 库通过选择nist图标。 选择第一次产生的 NIST 搜索命中 (图 10)。 如果产生的光谱相似性的化合物的兴趣是高于选择的频谱相似性评分 (这里≥ 0.9) 相比, NIST (图 10), 查找 RI (为 GC 列的相似的固定相, 薄膜厚度, 和柱直径) 给这化合物在文学 (例如, NIST 化学 WebBook22)。 计算 NIST 参考 ri (或给定多个 ri 值时的平均 RIs) 与实验推导的 ri 之间的相对差异。如果差额等于或小于用户指定的最大耐受值 (此处为≤±1%), 请将该化合物指定为 “注释”。 对经理示例文件中包含的所有感兴趣的化合物重复步骤 5.4. 2–5.4. 5。 对于复合识别, 比较标准溶液的 RI 和质量谱 (例如, 2–100毫克/升), 在4节中所述的相同条件下测量, 并与注明的化合物相同。 分析4节中解释的标准, 并处理步骤4.4 和5.2 中烷烃和经理的内容腺体数据所描述的结果数据。 通过选择工具来校准从标准获取的数据|日校准向导 |然后选择与以前使用的相同的 RI calibrant 文件。选择 “下一步”, 然后再选中 “下一步”, 然后选择包含从标准解决方案获取的数据的文件, 方法是单击绿色+符号。点击下一个, 然后开始计算标准化合物的 RI。注: 如果样品分析后不能及时进行标准分析, 建议再次分析 ri calibrants, 并对标准进行新的 ri 标定和计算。 为标准打开相应的文件, 并通过与 NIST 库的频谱比较来确认其身份, 如步骤5.4.2 中所述。 在确认标准的身份后, 将标准化合物的质量谱和 RI 添加到内部库中。为此, 单击绿色+符号并输入库条目的首选名称。确认并确定将标准化合物的质量谱和 RI 添加到库中。如果无法在库中看到新条目, 请激活 “刷新” 按钮。注: 如果已成功执行 ri 校准, 则由 MetaboliteDetector 确定的 ri 将显示在相应的库条目中。在创建标准的库条目后, 根据 RI 和光谱相似性的组合, 在 MG 提取物中识别这种代谢产物是可能的。 再次打开经理内容数据文件。选择工具 |设置 |标识。现在, 当标准化合物的 RI 被计算并添加到库条目中时, 将相似度分数从频谱相似性转变为组合评分。 单击放大镜图标, 然后选择在步骤5.4.5 中批注的化合物下方的三角形。 点击命中并检查为 “整体相似性评分” (OSS, 缩写的代谢物检测器作为 ‘ 整体 simil) 的价值, 考虑到频谱相似性和 RI 相似性评分的组合 (图 11)。注意: 如果在内部库中找到了命中, 它将显示在主窗口的右侧。 如果 OSS 位于用户定义的阈值之上 (此处≥ 0.9, 也由三角形的绿色颜色表示), 请将该化合物指定为 “已识别” (图 11)。 6. 通过 DG 内容检查经理内容提取物的污染情况 打开已通过 MetaboliteDetector (步骤 5.3.9) 计算出的化合物的 RIs 的 DG 样本的校准文件。 对镁含量样品和 DG 样品测量后获得的色谱叠加, 选择工具 |色谱叠加, 并通过绿色+图标选择两个各自的文件。确认为OK。 要查看叠加, 请选择窗口底部出现的色谱叠加表。 检查经理内容提取物 (图 12) 和 DG 内容提取物之间的重叠, 并从进一步的经理内容分析中排除重叠化合物。

Representative Results

图 13显示了在explodens腺体分泌物中假定代谢产物鉴定的实验步骤的示意图。此外, COCY 工作者蚂蚁的最重要的身体部分的示意图概述为提出的实验被提供作为补充图 S1 a, B。从蚂蚁解剖的主要步骤, 直到假定的代谢产物鉴定的经理的内容, 说明了补充图 S2。 为了分离出适合于 volatilome 分析的经理内容, 在整个运输、储存和解剖过程中都保持了冷却状态。为此, 蚂蚁被冷冻后, 他们收集与使用昆虫吸引 (1 和图 1)原位。在-20 摄氏度冷藏库中储存了2天后, 蚂蚁样品被运上干冰运往奥地利, 在那里他们立即被放在-80 摄氏度, 直到进一步的分析。适合被选择为隔离其经理内容的蚂蚁展示了一个胃区域, 它是圆形和完整的 (图 2A), 在最好的情况下, 有丰富的经理的内容, 如 tergites (图 2B) 之间可见的经理指出。Gasters 不适合进一步分析的蚂蚁, 如图 2C, D。图 3说明了 COCY 蚂蚁的经理内容隔离过程中涉及的主要步骤 (步骤 2.3-2.6)。独立的经理内容 (黄色在explodens的情况下, 但颜色可以范围从白色到红色在其他种类属于 COCY 组) 如图 14所示。 当解剖蚂蚁为他们的经理的内容, 应注意不要刺穿或破裂任何其他腺体或肠道 (步骤 2.5)。图 4显示了经过解剖的蚂蚁胃, 它仍然包含另外两个, 完整的腺体 (DG 和 VG) 隔离后的经理内容。如图 15所示, 蚂蚁肠道内容可见污染的例子。由于与 DG 内容的交叉污染, 位于经理之下, 不能完全避免, 该协议的一部分被描述为分析这些腺体, 以比较所产生的信号与来自经理内容提取 (6 节) 的信号。当解剖过程正确完成时, 每只蚂蚁可以获得约 0.75-1 2 毫克的经理含量。在这里描述的协议中, 五只蚂蚁的经理的内容被汇集在一起接受重复的样品 3.9-5.9 毫克每。 用 EtOAc (3 节) 提取分离腺储层含量, 用 gc-ms (4 节) 进行分析。explodens工人蚂蚁镁含量提取物的测定结果为许多假定的经理含量化合物的峰值和质量谱组成的色谱 (图 5)。两个主要代谢产物 1-(24, 6-trihydroxyphenyl)-乙酮 (id 4) 和 57-二羟基-2-methylchromen-4-一 (ID 5) 在镁含量提取导致了列超载, 这是为什么同样样品在更高的分裂比率再被分析的 50:1 (图 5, 嵌入)。例如, 由 DG 的成分可能交叉污染的经理的内容, 将是可见的额外峰值的 GC-MS 色谱显示晚 RTs, 从大约29分钟 (图 12)。不包括色谱峰和化合物的质谱也发现在溶剂空白, 起源于 GC 柱的固定相, 或从 DG 的内容在蚂蚁胃, 并随后处理与 MetaboliteDetector软件导致大约110个经理内容化合物以信噪比≥10。为了以后的代谢物注释和识别与 MetaboliteDetector 软件, 图谱校准和 RI 值确定的测量样本文件 (步骤5.3 和分步骤,图 6, 图 7, 图 8, 图 9)。所检测到的经理内容代谢物是基于频谱相似度与 NIST 库的结合而标注的, 这在所提出的示例中形成了 MetaboliteDetector 软件的一个不可分割的部分 (步骤5.4 和子步骤,图10).此外, 在文献中发现的 RI 值为相同或可比较的固定相, 薄膜厚度和 GC 列的直径被考虑为复合注释 (步骤5.4.4 和 5.4.5)。在制定了严格的匹配标准, 并确认了 RIs 和质谱的使用标准后, 如协议部分所解释的一个标准化合物 (步骤 5.4. 7-5. 4.15 和图 11), 可以确认约10的身份检测到的代谢物的%。由于关于C. explodens的 volatilome 的详细报告将在别处发表, 目前的研究集中在以前的一份出版物中已经描述过的那些代谢产物. 17 (这里的种类被选定作为 KB02-108; 参见烹调等。23).表 1概述了这些确定的化合物。 图 1: 昆虫吸引的示意图.在密封瓶或容器的盖子上, 两个孔被制成, 其中两个软管被放通过。一管 (T1) 的开口, 面对瓶内的内部是密封的网格罚款足以阻止昆虫。此外, 孔被制成的管, 以促进空气交换。管子 T2 的末端被指向被吸收入取样小瓶的昆虫通过 T1 吸入。请单击此处查看此图的较大版本. 图 2: 完好的与破碎的胃.(A) 完整的胃适合解剖。(B) 完整的胃几乎完全充满了经理的内容, 也适合解剖。(C) 和 (D) 折断的蚂蚁 gasters 与弹出和硬化的经理含量 (黄色), 可能打破在胃外壳在取样期间破裂。这些蚂蚁被排除在解剖、提取和进一步分析之外。T: tergite。请单击此处查看此图的较大版本. 图 3: 解剖过程中涉及的主要步骤.(A) 将胃区域与蚂蚁身体的其余部分分离。(B) 剥去外骨骼: tergite 1、tergite 2 (C) 和 tergite 3, 在这之后, 配对的黄色有色 MGRs 的内容几乎完全可见 (D)。(E) 通过解剖针去除粘性经理的内容。T: tergite。请单击此处查看此图的较大版本. 图 4: 在管理员内容被隔离后, 蚂蚁胃.在胃 (VG: 毒液腺和 DG: 杜福尔的腺体) 存在的另外两个腺体可以看到。在删除经理的内容 (隔离后的左侧可以看到黄色), 两个车厢仍然应该完好无损。这些腺体可以分析的方式与经理的内容一样。请单击此处查看此图的较大版本. 图 5: 经理含量提取物的代表性总离子电流 (TIC) 色谱.两个最丰富的 GC-MS 峰导致更对称的色谱峰, 当选择较高的分裂率 (50:1), 而不是常规的2:1 比 (见插图)。请单击此处查看此图的较大版本. 图 6: 测定 RI calibrant 色谱中第一个可检测到的烷烃.选择了第一烷烃峰值最大峰值下的三角形。该烷烃 elutes 在6.31 分钟, 并显示最高的频谱相似性 (这里, ‘ 规格, sim ‘) 到图书馆条目 ‘ Alkane_C09 ‘。为了确认烷烃的身份, 质量谱被比作一个图书馆 (例如, NIST 化学 WebBook22)。在所提出的例子中, 壬是由其分子离子识别的, 其值为128。请单击此处查看此图的较大版本. 图 7: RI 校准与使用 n-烷烃标准混合物.已打开 ri calibrant 数据文件, 并选择了 “ri 校准向导” 功能。应检查校准表中所描述的 RI 的保留时间是否正确匹配。表中正确显示了 alkane_C09 (壬) 的 RT 6.31 分钟。请单击此处查看此图的较大版本. 图 8: 校准表中显示错误的 RTs.RTs 不正确显示 (由错误的 rt 值显示, 或者显示为-1 的缺少 rt 值)。请单击此处查看此图的较大版本. 图 9: 校准表中错误 RTs 的手动更正.通过为各自的烷烃插入正确的 RT, 可以手动纠正错误的值, 如 Alkane_C39 所示。请单击此处查看此图的较大版本. 图 10: 选择化合物的质量谱与 NIST 库条目的比较.在选择峰值最大洗脱6.16 分钟 (RI 891) 和激活的 ‘ NIST 搜索 ‘ 功能 (红圆圈), 一个光谱相似性0.99 为2庚显示。请单击此处查看此图的较大版本. 图 11: 经理内容提取中的代谢产物识别.将样品的色谱中的891的复合洗脱物的质量谱和 ri 与含有 RIs 的内部库项和测量标准化合物的光谱进行比较。如果 “总体相似性评分” (OSS, 在代谢物检测器中缩写为 ‘ 整体 simil. ‘ 在内部图书馆中的化合物和样本文件中的化合物之间实现质谱和 RI) 是≥ 0.9, 该化合物被指定为 “已识别”。在这里, 2-庚的内部库进入和 RI 891 的复合洗脱之间的 OSS 是 0.96, 这导致了经理内容提取中 2-庚的识别。请单击此处查看此图的较大版本. 图 12: DG 含量提取物 (红色) 和经理含量提取物 (蓝色) 的 TIC 色谱剖面 (最小29到最小 35) 的叠加.在 DG 含量提取物中, 与重叠 (假定) 化合物相对应的峰值区域高于经理含量提取物;这些化合物可能来源于 DG, 因此被认为是经理含量提取物中的 (次要) 污染物。在explodens经理内容提取的情况下, 由假定的 DG 污染产生的色谱峰约为 29, 这部分的色谱可以排除在对经理内容的进一步分析中。请单击此处查看此图的较大版本. 图 13: 在气相色谱分析后, 在腺储层含量提取物中, 由蚂蚁样品到代谢产物的注释/鉴定的示意图工作流.这里提出的协议解释了所有的实验步骤从经理的内容分离, 通过解剖蚂蚁和 GC-MS 分析, 以及数据评估 (用黑色表示)。另外, 昆虫分泌物也可以就地生成和收集 (用灰色表示)。请单击此处查看此图的较大版本. 图 14: 提取前分离的蜡质经理的内容.(a) 两个 MGRs 的内容在一起, 但 (B) 它们也可以在隔离后分开。在C. explodens中, 经理的颜色是橙色的, 但可以从白色到红色的 COCY 组的其他种类。请单击此处查看此图的较大版本. 图 15: 由昆虫肠道成分 (褐色) 相互污染的独立的经理分泌物的图示.这些类型的经理分离被排除在提取和进一步分析。请单击此处查看此图的较大版本. Id 代谢 产物 琐细的名字 InCHI 字符串 求和公式 1 Heptan-2-one InChI = 1 s/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/h3-6H2,1-2H3 C7小时14O 2 n-Undecane InChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3 C11H24 3 n-Heptadecane InChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3 C17H36 4 1-(24, 6-Trihydroxyphenyl)-乙酮 Monoacetylphloroglucinol InChI = 1 s/C8H8O4/c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 3-7 (8) 12/h2-3, 10-12H, 1H3 C8小时8O4 5 57-二羟基-2-methylchromen 4-一 Noreugenin InChI = 1 s/C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5/h2-4, 11,13H, 1H3 C10小时8O4 表 1: EtOAc 提取物中发现的代谢产物, 从explodens小工人蚂蚁中分离出来。提出了选择的代谢产物。 补充图 S1。概述了属于 COCY 蚂蚁 (小工人) 的最重要的身体部分在本手稿中提出。(A) MGRs 以黄色显示。它们的胃部分用于 volatilome 分析。(B) MGRs 的胃部分位于 tergites 1 至3下。T: tergite。请单击此处下载此文件. 补充图 S2。提出的实验的示意图概述.从蚂蚁的解剖的主要步骤, 直到假定的代谢产物的鉴定在经理的内容被说明。请单击此处下载此文件.

Discussion

在这篇手稿中, 我们提出了一个完整的协议, 以分析肥厚 MGRs 中发现的 volatilome explodens小工人蚂蚁的内容。由于在这里使用的蚂蚁可能会 ‘ 爆炸 ‘ 和弹出他们的经理的内容不受控制的方式, 当接触钳, 建议使用 “软” 收集技术提供的昆虫吸引 (图 1)。对于一些蚂蚁物种, 包括 COCY 蚂蚁, 可能有必要限制的最大数量的蚂蚁每50毫升瓶, 因为否则的自我中毒的蚂蚁 (例如,在顶空的甲酸积累) 可能发生。为了冻结野外的蚂蚁, 可以使用一个装满了冰冻冷藏包的凉袋子。样品应迅速冻结和储存在冷却条件下 (例如, -20 °c, 最好在-80 摄氏度), 但不建议杀死和储存的蚂蚁在液氮, 因为他们的腺体的伤害增加了这种方法观察到。

提出的无溶剂解剖方法适用于获得冻干工人蚂蚁中的蜡样下颌腺储层含量及其他腺体。对于 explodens 的 volatilome 分析, 在解剖过程中要考虑的主要方面是蚂蚁的连续冷却 (步骤 2.1.4), 并将 MG 样品与其他腺体含量/流体的交叉污染降到最低.ant 胃 (步骤2.5、 图 4和图 15)。相当一部分冰冻的蚂蚁可能会被破坏, 或者是因为蚂蚁在取样时 “爆炸”, 或者在从取样点到实验室的干冰运输过程中被损坏。如果胃区域被破坏, 这些蚂蚁不适合进一步分析 (图 2C, D)。如果只有触角和腿丢失或折断, 这些蚂蚁可能仍然被用来提取的经理的内容和进一步的分析。由于冷却的C. explodens蚂蚁的经理含量有一个蜡样的一致性, 它是直向前, 以隔离他们与使用解剖针 (步骤 2.5,图 3E,图 14)。在处理粘性经理的内容时需要额外的照顾。它可能坚持任何与它的身体接触, 也经常坚持解剖钳, 这增加了污染的其他样本的风险。有必要只用解剖针触摸经理的内容, 并立即将其转移到用于提取的玻璃瓶 (步骤2.5 和 2.6)。此外, 建议在蚂蚁或腺体类型 (步骤 2.8) 之间切换时, 用甲醇/H2O 混合物清洗解剖设备。

其他蚂蚁物种的腺体含量可能存在于液态状态, 即使在冷包冷却期间也是如此。在这种情况下, 整个腺体包括膜5月1日被隔离和刺穿后获得的内容。在细毛细管吸管的帮助下也可获得液体分泌物。由于平均身体长度约4-5 毫米 (没有触角), explodens的工人属于 COCY 组的较小种类。他们经常肿胀的胃包括大约 2-2, 5 毫米长和 1-1. 5 毫米宽。COCY 组中已知物种数量最多的工人可以达到大约8毫米的体长, 胃大小约为3毫米, 宽度为2.5 毫米。由于该议定书非常适合解剖和调查不同 COCY 物种大小的个体蚂蚁和 gasters, 所以在这里使用的解剖仪器和显微镜可能需要加以调整, 以适用于较小的蚂蚁或较小的器官。此外, 每个分析样本的蚂蚁数量也可能需要增加。

在解剖蚂蚁为经理的内容, 这是至关重要的, 不损害任何其他腺体或肠道-其中的内容可能会交叉污染的样本 (步骤 2.5,图 4和图 15)。在最佳情况下, 在经理内容的提取之后, DG 和 VG 都能明显保持完好 (图 4)。污染物与 DG 的内容位于 MGRs 之下, 是难以完全避免的。原因可能还包括在从取样地点到实验室的干冰运输过程中对腺体完整性的部分破坏。在取样或爆炸过程中, 它也可能会损坏, 正如我们在一些被调查的蚂蚁中所注意到的。由于 DG 内容可以与经理的内容 (3 和4节) 进行分析, 因此在分析了经理的内容样本 (6 节) 之后, 结果可以与生成的数据进行比较。对于由explodens蚂蚁获得的经理内容提取物, DG 中的化合物也开始在色谱中洗脱晚 (图 12)。为防止将 DG 化合物误认为经理成分, 可以排除相应的代谢产物进行进一步分析。从对其他蚂蚁物种的研究中, 人们知道, 在 GC 色谱中, 洗脱还可以含有 (高度) 挥发性化合物1,24, 通常是早期的。

在以往的研究中, 对 COCY 蚂蚁的经理含量的化学成分, 整体蚂蚁或他们的整个 gasters 分析了16,17,18,23, 而这里的经理的内容他们自己得到了通过解剖蚂蚁。

分析被解剖的经理的内容允许调查人员进行广泛的生物化学研究, 包括在其中包含的代谢物的鉴定。由于在这里进行的研究集中于识别explodens的经理所包含的挥发性成分, 所以选择了 GC-MS 进行分析 (4 节)。为此, 提取物最好在准备后立即测量, 或储存在-80 摄氏度, 直到分析。应当指出的是, (扩展的) 贮存可能会导致提取物的化学变化 (见步骤3.3 和4.2 之后的注意事项)。由于经理内容的集中程度可能涵盖若干数量级的范围, 因此可能需要分析不同 GC 分割比率下的经理提取物。由于使用的蚂蚁的经理内容提取中的两种主要化合物在2:1 的拆分比率中导致了列超载, 因此, 第二次分析了 50:1 (步骤 4.3.1.2and图 5) 的更高的拆分比率。4节中介绍的 gc-ms 参数设置适用于材料表中指定的 gc-ms 设备生成的数据。在 RI calibrants (步骤 4.1.1) 旁边, 还应分析溶剂空白 (步骤 4.1.2), 以识别后续数据分析过程中的非生物工件和污染物。对于代谢物的识别, 同样重要的是测量在相同的 GC-MS 条件下, 用于分析样品萃取剂的真实标准 (以下步骤 5.4.7and)。为了提高最终数据的准确性和可靠性, 建议在同一测量序列中分析所有样本类别 (溶剂空白、RI calibrants、样品提取物和标准)。此外, 对真实标准的分析应与样品提取物所观察到的浓度相当。这有助于提高 RI 值的准确性和样本和标准质量谱之间的相似性, 这将最终导致增加和更有意义的代谢物注释/鉴定。为此, 可以用不同的分裂因素反复测量标准。

为代谢产物识别, 复杂的软件, MetaboliteDetector 用于光谱反褶积和 RI 和光谱比较到一个被实施的 NIST 图书馆并且到一个建立的内部图书馆 (部分 5)。建议在64位基于 LINUX 的操作系统 (如‘ 工具) 上运行 MetaboliteDetector, 并复制生成的 *。CDF 数据文件 (步骤 4.4) 从便携式数据存储设备到本地硬盘上。MetaboliteDetector 能够以质心或轮廓 netCDF 格式导入原始 GC-MS 数据。大多数 GC MS 仪器的软件应该能够将记录的原始数据转换为这种格式19。在开始数据分析之前, 强烈建议阅读以前 MetaboliteDetector 软件版本可用的文献, 以熟悉这些功能和图形用户界面19,25,26。

为了对样品提取物中的复合峰进行 ri 标定和后续的 ri 值计算, 采用了含有 RIs 和 calibrants (这里是 n-烷烃) 的光谱的库。这样的库可以是自建的, 或者是现有的一个 (“CalibrationLibrary_Alkanes”) 可以下载27。提供的默认 calibrant 库包含 RIs 和光谱, 用于从 C09 到 C39 的 n-烷烃, 这些分析如第4节所述。提供的库使使用代谢物检测器的用户可以直接从数据的校准过程开始。如果需要, 这个库也可以扩展为进一步的烷烃更多的条目。根据参考文献和实验推导出的 RIs 和质谱的相似性 (见步骤5.3 和分步,图 7, 图8,图 9), 可以执行化合物的注释或识别 (步骤5.4 和子步骤,图 11)。同样重要的是, 在自动化数据处理与 MetaboliteDetector, 用户将手动检查正确的峰值采摘和频谱反褶积检查的质量光谱基础上的 ‘ 三角形 ‘ 为每一个假设的化合物利益。此外, 根据 GC-MS 仪器和用于数据生成的参数设置, 可能需要 adaptions 所提供的 MetaboliteDetector 设置。MetaboliteDetector 软件有能力执行比本手稿中解释的更多的有用操作,例如,显示提取的离子电流 (EIC) 图谱, 出口图谱为. csv, 自动批量量化化合物, 以及更多。

本手稿中提出的协议可以作为对其他研究人员进行的实验的建议, 重点是从昆虫中分离腺体或腺体的内容, volatilome 分析, 以及代谢产物的鉴定。

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项研究的经费是通过维也纳科学和技术基金 (WWTF) LS13-048 向新闻处取得的。特别感谢去黛安 w 戴维森 (犹他大学; 现在退休) 分享她对婆罗洲 COCY 蚂蚁的知识与我们。我们赞赏吉隆坡 Belalong 实地研究中心 (KBFSC) 和马来西亚文莱达鲁萨兰国 (UBD) 政府的项目批准以及文莱林业部和文莱的研究和创新中心获得许可收集蚂蚁和批准和签发出口许可证。特别感谢 UBD 和 KBFSC 的工作人员, 特别是穆罕默德 Salleh, 泰迪蔡李, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, 陈眉梅, 鼓山 Tennakoon, 以促进我们的研究。

Materials

Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP Sarstedt 62,559,001 see Figure 1 in manuscript
PVC Tubings Rehau 290 4489 see Figure 1 in manuscript
Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size Antstore 1000378 see Figure 1 in manuscript
Freezer Severin KS 9890  -20 °C or lower
polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm Thorsten Koch 4260308590481
Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm Aldrich BR455742
Cold pack 150 mm x 100 mm Elite Bags 1998 freeze to -20 °C
Bucket with crushed ice
1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening La-Pha-Pack 11090500
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm La-Pha-Pack 9151799
Stereomicroscope Bresser 5806100
Forceps, Superfine Tip curved Medizinische Instrumente May, Norman May PI-0005B
Forceps, Superfine Tip straight blueINOX BL-3408
Dissection needle 140 mm, pointed, straight Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1110301
Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën fisher scientific 15654740
Distilled water
Rotizell-Tissue-Tücher Carl Roth GmbH + Co.KG 0087.2
Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % Carl Roth GmbH + Co.KG 4442.1 freeze to -20 °C
Vortex Genie 2 neoLab 7-0092
0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip  La-Pha-Pack 06090357
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum,  45° shore A, 1.0 mm La-Pha-Pack 9151819
Alkane standard solution C8-C20 Sigma-Aldrich  04070
Alkane standard solution C21-C40 Sigma-Aldrich  04071
n-Hexane SupraSolv Merck 104371
GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister Gerstel
Agilent Gas chromatograph 6890 N Agilent
Gooseneck splitless Liner Restek 22406
Helium (5.0 – F50) Messer 102532501
GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm Agilent 19091S-433UI
Agilent Mass Selective Detector 5975B Agilent
MSD ChemStation Data Analysis Application software  Agilent
MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) Hiller K download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
Calibration Library for MetaboliteDetector Hiller K download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
MD Conversion Tool for NIST-library Hiller K download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
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Referenzen

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Mandibular Gland ReservoirVolatilome AnalysisGC-MSMetabolite ProfilingAnt Chemical EcologyInsect MetabolomicsDissectionIsolationVolatile Organic Compounds

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Hoenigsberger, M., Kopchinskiy, A. G., Parich, A., Hiller, K., Laciny, A., Zettel, H., Lim, L. B., Salim, K. A., Druzhinina, I. S., Schuhmacher, R. Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean ‘Exploding Ants’ (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector. J. Vis. Exp. (138), e57652, doi:10.3791/57652 (2018).
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