マイクロマニピュレーション技術形成ダイナミクスの解析と細胞骨格のレギュレータの売り上げ高

1. Coverslip の洗浄と殺菌 15 mm (直径) カバーガラス (その 1) 40 mL 37 %hcl と 60 mL 100% の混合物を含む 500 mL フラスコを浸しエタノール (洗浄ソリューション 100 mL あたり 100 以上 coverslips)。注: 新しく購入した場合でも coverslips 必要があります厳しく洗浄する表面上に細胞を播種する前に。これは肉眼的に見えないが、接着と生きているセルの適切な広がりを妨げることができます効率的にグリースの薄膜を含むかもしれないためにです。そのようなフィルムを効率的に酸または塩基を含む溶液で削除できるに対し (フィッシャーらを参照してください。13)、我々 は日常的に上記酸/アルコール混合物を使用します。 含有回転シェーカー上で 30 分間カバー ガラス フラスコを振る。自由に旋回するが、頻繁に破壊を避けるために十分にゆっくりカバーガラスを可能にする速度を選択します。再利用する場合は、壊れたガラスの破片を削除するソリューションをろ液します。 少なくとも 200 mL 滅菌水の入ったフラスコにカバー メガネを転送し、酸性の臭いが消えているまで何度も水を交換しながら回転シェーカーで孵化させなさい。数時間にわたって複数の洗浄は、塩酸エタノール トレースの完全な除去に適しています。 フィルター紙のシート上の個々 のカバー ガラスを乾燥させます。 場所 (直径) 10 cm シャーレの下部にカバー メガネ フィルター ペーパーおよび熱カバー ドライ滅菌します。カバーガラスにくっついてしまうのでオートクレーブに入れることは避けてください。 2. 細胞、トランスフェクション、カバーガラス上播種の治療 10% ウシ胎仔血清、2 mM グルタミンと 37 ° c, 7% CO21% ペニシリン-ストレプトマイシンを含む DMEM (4.5 G/L グルコース) の標準的な細胞培養条件によると F1 B16 マウスメラノーマ細胞を成長します。 DMEM (4.5 G/L グルコース) 含む 10% 牛胎児血清、1 mM ピルビン酸ナトリウム、1 x MEM 非本質的なアミノ酸標準培養条件 (37 ° c、7% CO2培養インキュベーター) に従って薬剤の NIH3T3 線維芽細胞を成長します。、2 mM グルタミンと 1% ペニシリン-ストレプトマイシン。 Transfections、B16 F1 セルを 3 cm (直径) プラスチックの皿に 10 センチメートルの皿と 1:5 の比率で通路で 100% 合流点まで増えます。 同じ日に B16 F1 セルが少なくとも 6 時間の遵守が許可された後は、活性型 GFP PA アクチンの 500 ng/皿またはタグ付きの EGFP β-アクチン プラスミド DNA transfect します。MCherry エンコード ベクトルを用いた PA GFP アクチンの共同 transfections は、1 μ g のプラスミド DNA 3 cm 皿あたりの合計を混在させます。 トランスフェクション試薬 (材料表) と B16 F1 セルを transfect します。3 cm 皿ミックス 150 mm NaCl 500 を含む 200 μ L 150 mm NaCl のトランスフェクション試薬の 1 μ L を含む 200 μ L で ng の DNA の構築 (すなわちDNA (μ g): 試薬 (μ L) 1:2 の比率が使用された)。 トランスフェクション混合物常温 (RT)、ピペットで移しなさい drop-wise セルを含む 3 センチメートルの皿の上に 20 分間、インキュベートします。優しく料理をミックスし、37 ° C、7% CO2で一晩インキュベートを旋回します。 50 mM トリス、pH 7.4 と 150 mM の NaCl を含むラミニン コーティング バッファーを準備します。 B16 F1 セルのラミニン (ラミニン コーティング バッファーで 25 μ g/mL) の 150 μ L を広めることで 15 mm カバーガラスをコートし、室温 1 時間インキュベートNIH3T3 細胞のフィブロネクチン溶液 (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 25 μ g/mL) でカバーガラスをコートし、室温 1 時間インキュベート PBS、ラミニン、フィブロネクチン培養カバー ガラスを洗浄し、PBS を吸引 transfected セル 2 mL を加えます。 シード transfected B16 F1 セル (1:30 に合流皿から比)、ラミニン被覆カバーガラス上、トランスフェクション後の日に。NIH3T3 細胞を播く (1:20 で合流の皿から比) フィブロネクチン被覆カバーガラス上。 細胞の顕微鏡の前に 37 ° C で培養インキュベーターで一晩ラミニン、フィブロネクチン コート カバー ・ メガネに広がりを許可します。また、顕微鏡実験は細胞は少なくとも 2-3 h の普及できることを考えれば、同じ日に開始できます。 3. 顕微鏡イメージング商工会議所総会 イメージング顕微鏡検査 (図 1、) のため商工会議所熱導電性 RC 26 アルミを使用します。注射器 (図 1b) を使用して、プラスチック製のシーラー オープニングの輪郭の周りにシリコン グリスを塗る。 商工会議所 (図 1c) に細胞側でカバーガラスを配置します。 Coverslip と商工会議所との間のセキュリティで保護されたシールにカバーガラスの上にプラスチック製のシーラーを配置します。漏れ (図 1d) 媒体を避けるために商工会議所にスライド式のクランプをねじ込んで (斜め coverslip の破損を避けるため) にプラスチック製のシーラーを修正します。 ピペット 37 ° C 予熱した顕微鏡媒体中心部に。蛍光が小さくなり、したがって顕微鏡用に最適化、中、上記が f12 キー-ハムではなくさらに CO2 (図のない状態で細胞を培養するため 20 mM HEPES を含む DMEM 培として同じレシピを使用します。1e)。 商工会議所の指定されたスロットに熱感知器を挿入し、商工会議所の電極を 37 ° C (図 1f) の一定した温度を維持する TC 324B 自動温度コント ローラーにリンクします。 目的に浸漬油の小滴を置き、上に商工会議所を配置します。 チャンバー内に取付時の温度低下から回復し、顕微鏡媒体に適応できるように、少なくとも 10-30 分のための細胞を孵化させなさい。 顕微鏡が開始される前にメディア コンポーネントおよび培地の蒸発により血清の不適切な集中を避けるため商工会議所 (約 800 μ L) の中央貯蔵所で培養液を取り付けます。開いている部屋で長時間顕微鏡セッションは、蒸発中のルーチンを変更する必要があります。 4. 注入法 コート、coverslips、細胞を準備し、上記のようにイメージングの商工会議所を組み立てます。 注入する浄化された蛋白質の因数を解凍 (通常 10 μ L 以下) と適切なマイクロインジェクション バッファーで希釈します。注: バッファー組成にタンパク質と細胞の種類によって異なりますが 6.95 と 8.00 の間の pH を使用して PBS を使用しないように世話をほとんどセル PBS を注入すること好きではないようです。 Rac1 マイクロインジェクションの 100 mM の NaCl、50 mM トリス塩酸 pH 7.5、MgCl2, 5 mM 1 mM DTT を格納するバッファーを準備します。Mg2 +イオンは小さい gtp アーゼの安定性に不可欠です。メモ: タンパク質濃度は通常 0.1-1 間異なる mg/mL (最大 2 mg/mL)、蛋白質によって、実験、およびセルの種類を入力します。 該当する場合は、注射の前に針流の存在を確認することができ、実験後の成功した注射のマニュアルを許可をタンパク質溶液に不活性デキストラン (0.5 μ g/mL, 70 kDa) などの蛍光色素を追加します。注: 次注入 Rac1 のダイナミクスの直接蛍光標識タンパク質のリクエスト可能になるのみを目指したがないここでの実験。蛍光色素や蛍光タンパク質を融合蛋白質の結合は可能、しかし回避ここ Rho ファミリー GTPase Rac1 のような小さい蛋白質の特定のシグナリングの機能に支障を及ぼすおそれを抱いてそれに (20 kDa)。 針の目詰まりキャピラリーのマイクロインジェクションに存在する場合につながるタンパク質の凝集体を削除する、少なくとも 30 分間、10,000 × g でタンパク質溶液を遠心します。 柔軟なピペット チップ/microloader チップを使用して後ろ側から 1 μ L 注入混合物のマイクロインジェクション針 (マイクロインジェクション毛細血管) をロードします。 空気の泡が針の先端に存在する場合、それらを削除するために針ベースを軽きます。針の先端は、ニードルの目詰まりの原因の乾燥を避けるために急速に進みます。 マイクロマニピュレーション デバイス上の持針器を慎重に調整します。針ロードする前に、位相コントラスト イメージングに倒立顕微鏡を使用する顕微鏡コンデンサーを妨げることがなく針を上下に移動するのに十分なスペースがあります。 針ホルダーにマイクロキャピ ラリーをねじ込む時に細胞培養液に針の先端を透過する前にマイクロインジェクション加圧装置を使用して針に圧力 (20-50 hPa 背景圧力) を適用します。注: 媒体、針のときの圧力をアクティブにするを毛管力によって吸引される中で結果、従って興味のソリューションの注射を禁止します。 (容易に低倍率の目的を使用して) ビューのフィールドに針を置きます。マイクロインジェクション実験用 40 × 乾燥対物はここに使用されました。 肉眼的 (これは加速する針の先端を見つけること) 対物レンズの中央を基準にして垂直位置に針の先端を配置します。位相差光学顕微鏡を使用すると、ビューのフィールド、光学面を基準にして水平面内針の先端も上記細胞層に移動します。注: 針最初ビューのフィールドに影として表示され、焦点面は、先端を視覚化する調整できます。針の先端が見つかったら、細胞層に近い位置の下に針の先端が続く光の平面を徐々 に低きます。 蛍光デキストランを使用するとき蛍光チャネルに切り替えることによって針の流れを確認するし、圧装置を使用して一定の「背景」の流れを取得する流れを調整します。注: この記事で述べる接触セルを介して細胞膜を壊すことによって媒介される手動注入表面し、定針フロー中に針先の動きを穏やかな。これは後細胞集団に続いて高い細胞数の注入に適している注入イベント中にプログラムされた針を下げるとニードル圧力増加を伴う自動噴射装置から区別されねばなりません。解析。ここで説明する方法は、および、マイクロインジェクション前後後タイムラプス顕微鏡による単一細胞解析に最適です。 興味のセルは、セルの上針は徐々 に低きます。 Microinject する準備ができたら、フォーカスでセルを保ちながらマイクロマニピュレーター ジョイスティックの罰金のピニオンを使用して細胞核領域に向かって徐々 にニードルを下げます。 マイクロインジェクション、細胞膜、細胞内に侵入、または顕微鏡のセットアップに非常に穏やかな蛇口での過渡膜破裂を援助するだけで十分ですが、セルをそっと触れます。注: 針の先端に白いドットはプラズマ膜との接触の時間を示します。針の先端が再シール膜破裂、次のセルに注入剤の穏やかな流れを伴います。 セルへの流れが見えるとすぐに注入プロセスを停止 (理想的には 0.3 以内 s) 媒体に針の先端を移動することによって。蛍光デキストランを使用する場合、成功した注射は蛍光によってすぐに化も。 必要な場合は、コマ撮り画像集録、マイクロインジェクションの前後を開始します。注: 薬物や阻害剤のローカル アプリケーションはここでは、すべてのステップで、マイクロインジェクション イベント自体を除いて実行できます。ローカル アプリケーションの実行中の分子の拡散を流量圧力によって制御および蛍光、文書化でき、針の先端を目的の高さに配置できます。ローカル アプリケーション実験の例としては、例えば、中小企業ロットナー14または Kaverinaらを参照してください。15 次の顕微注入、タンパク質の効果が発生するまでを待ちます。異なった蛋白質のためと期待される成果に応じて、インキュベーション時間が異なる場合があります。小さい gtp アーゼ Rac1 lamellipodium 形成の反応開始 1 分以内またはそれ以下にすることができますが、(図 1g, h) を完全に開発する平均で約 10-15 分かかります。 マイクロインジェクションの後の細胞の生存率を判断します。注: 不適切または有害な注射は、非固有セル端撤回や細胞膜破壊を伴っている頻繁になる細胞損傷を引き起こす可能性が。 フラット細胞領域で注射のため発生する可能性が、上部と下部の両方の細胞膜をつつきは避けてください。注: 注入量を最小限に抑える必要があります (理想的に 2 mg/mL を頻繁に針の目詰まりによる非実用的になる可能性があります。ただし、これはまた、品質と精製タンパク質の挙動に依存します。例えば、蛍光結合アクチンの注射は針の先端の濃度に依存し、やむを得ない重合により、複雑し、これが今日実行されるほとんど (小さいらを参照してください。16)。 前に中、または、マイクロインジェクションの効果の後、FRAP や光に対して実行できる同じセル (セクション 5 および 6 を参照)。 5. FRAP の手順 Transfect プラスミッド DNA の蛍光タグ興味の蛋白質を符号化と利子 (B16 F1 細胞) の細胞型 (ここでは、β-アクチンの EGFP タグ付きバージョンを使用)。ラミニン被覆カバーガラス (ステップ 2.10) 上細胞を播きます。 イメージングの商工会議所 (セクション 3) を組み立てます。 葉状地域退色の次の設定を使用: 65 mw レーザー (変数実験のセットアップおよびレーザーのソースによると);10 ピクセル レーザー ビーム径;1 ms の漂白剤ドウェル時間/ピクセル;500 ms GFP 露光時間;1,500 ミリ秒の時間間隔。100 X 1.4NA アポクロマート目的で本実験を行った。 Photobleached 領域の寸法の精度を確保するためのレーザー校正を実行します。前に、任意のセル/蛍光信号を欠けている領域にビューのフィールドを移動し、ディスプレイ上の画像を確認します。 それぞれ拡大ボタンをクリックして対物レンズの倍率を選択し、(3-5 mW) のレーザー出力を削減、”パネル |強度」メニュー。Visiview ソフトウェア (v2.1.4) 手動キャリブレーションを開始するを選択、”構成 |FRAP」メニューをクリックし、”調整 |マニュアルを調整」メニュー。シャープなドットとレーザーを区別できることを確認します。そうでない場合、再び焦点を合わせるまたはレーザー ハードウェアを調整します。 手動であらかじめ決められたソフトウェア X-Y 座標にレーザーを導くことによって、キャリブレーションを実行します。これはソフトウェアに具体的には現在の拡大率をユーザー定義の領域にレーザーをターゲットにする方法を指示します。 レーザーをトリガーする前に GFP のチャネルに切り替えるし、画像/時間経過の取得を開始します。 ディスプレイを見ながら GFP チャンネルで photobleached をする領域を手動で描画します。 405 nm レーザの手動トリガー画像集録の開始後、少なくとも 3-4 フレーム退色を開始します。退色前のフレームを取得は、後でデータ分析で画像の正規化に必要です。 6. Photoactivation の手順 注: ソフトウェア、顕微鏡のセットアップ、設定、レーザー パワーを除いて FRAP のものに似ています。Photoactivation、たたきと比較して重要な違いは、405 nm レーザー電源よりかなり低い PA GFP を同時に退色せずにアクティブに、退色を使用する必要がありますを採用すること。 共同関心のセルタイプを transfect (B16 F1 ここ細胞; ステップ 2.5 を参照) プラスミド DNA にエンコード PA GFP アクチンと別の蛍光標識したタンパク質 (例えば、 mCherry または mCherry Lifeact)。注: ほとんどの場合、mCherry 陽性細胞もなります PA GFP アクチンのベクトルは、後者の photoactivation の前に GFP チャネルでは通常見られ肯定的です。MCherry 陽性細胞も PA GFP 陽性であることのチャンスを高めるためには、mCherry:PA の 1:2 のトランスフェクションの比率を使用して-GFP-アクチン。このプロトコル、mCherry を発現している細胞の 90% 以上と、PA GFP アクチンの巧妙な活発化が表示されます。 ラミニン被覆カバーガラス (ステップ 2.10) 上 F1 B16 細胞を播きます。 イメージングの商工会議所 (セクション 3) を組み立てます。 Photoactivation の実験を開始する前に必要な場合は、選択された目標 (ステップ 5.4-5.6) でレーザー調整を実行します。 500 ms (実験計画) によって露出と 1,500 ms 間隔に GFP/488 nm の画像の取得を設定します。 ソフトウェアの設定を調整する「波長シリーズ」正方形をマーキングし希望のチャンネル数を選択することによってデュアル チャネルやトリプル チャネルの時間経過映画を取得、”取得 |波長”メニュー。時間経過映画に位相差顕微鏡および GFP チャンネルがつけたことをお勧めします。 必要に応じて、mCherry チャネルがあります。ただし、光損傷を誘発する可能性がありますあまりにも多くの光を細胞を公開します。これは、セル室のシールに効果的な治療の必要がありますが Oxyrase17など酸素スカベン ジャーと避けることができます。 MCherry チャネルの transfected セルを検索します。 レーザーをトリガーする前に画像/時間経過集録を開始し、位相コントラスト チャンネルのセンサーに表示領域を手動で描画します。 405 nm レーザの手動のトリガーの photoactivation を開始 (から 5-15 mW 間の強度設定、「パネル |強度」メニュー)、画像集録の開始後、少なくとも 3-4 フレーム。 7. データの解析と縛る結果のプレゼンテーション 注: この場合は癒着と突出ケラトサイトの先端に関連付けます、VASP のアクチンの動的アセンブリのサイトで蓄積蛋白質の売り上げ高を調査するため提示メソッドを使用します。Lamellipodium 先端での売り上げ高を分析しているが、VASP または他の蛋白質および他の細胞内コンパートメントの売り上げ高を調査するための分析の同じ原則を適用できます。 久万ソフトウェアの Visiview から派生したコマ撮りムービーを開きます。この記事では、久万 v7.8.10 が使用されました。 手動でアウトライン久万のそれぞれの領域によって photobleached 領域の輝度値を導出します。葉状の強度の変化を追跡ために (すなわち端が突き出ている場合)、必要な場合 photobleached 領域の一部または全体をカバーし、後続のフレームの位置を手動で調整 lamellipodium の先端の形状を描く先端変位時に各コンポーネント。 背景とフォトブリーチを行なった買収の補正のため、細胞外領域を分析します。図 2、測定された強度の代表的な地域を参照します。 ROI を選択して、メニューを使用して久万で強度値を抽出」メジャー |地域の測定」。「設定」メニューの「経過時間」と「平均強度」のオプション選択を確認します。「ログを開く」をクリックし、「動的データ交換」を選択。Excel スプレッドシートを開くし、久万値を Excel に貼り付けるに再び「ログを開く」ボタンをクリックして”OK”をクリックしてします。注: これらの値は、蛍光の回復曲線を生成するために使用されます。 (退色する前に領域の強度に正規化) photobleached 地域の lamellipodium 先端の蛍光回復曲線を生成すると、次の式が適用されます。   式 1場所: FRAPTnは次のフォトブリーチング; 興味の各フレームの photobleached 地域の強さTnは興味の各フレームのセル (背景) の外部にある領域強度以下フォトブリーチを行なった。InsTnは、(時間をかけて買収フォトブリーチング正規化に使用); 退色、次の興味の各フレームの領域強度内平均 2FRAPT-1はフォトブリーチング; 前に photobleached 領域強度です。T-1は退色。 前に、のセル (背景) の外部にある領域強度です。InsT-1が退色する前に興味の各フレームの領域強度内平均 2. 興味の時間フレームごとに方程式 1を使用して、調査するすべてのタイム フレームを含む蛍光回復曲線を取得します。時間の長さは厳密に調査中のタンパク質に依存しています。不明ですが、タンパク質の離職率を取得する予備的な実験を実行します。 回復の半分の時間を計算する、シグマ プロット (v.12) に対応する時間 (単位は秒) の蛍光回復曲線の値を貼り付けるし、フィットを使用して曲線を実行、「ダイナミック フィット ウィザード |最大指数上昇は”ツールです。[モノラル指数 (シングル、3 つのパラメーター) または bi 指数 (ダブル、4 パラメーター) によって最高のカーブ フィット機能。 モノラル指数関数に次の数式を使用します。   方程式 2 Bi 指数関数に次の数式を使用します。   式 3 パラメーター”b”と”d”回復の半分時間を計算する Excel にシグマ プロット (式 2または式 3) から派生を貼り付けます。次の式が適用されます。   方程式 4または   式 5 モノラル指数関数の結果に合わせて正確な曲線として、方程式 4のみが適用されます。 モノラル指数関数が良いカーブ フィットされない、式 4と式 5を解くことによって bi 指数の数式が適用されます。2 つの異なるタンパク質分数を表すものとして回復の結果 2 半分時間を検討してください: 急速とゆっくりと交換率それぞれ。 8 FRAP 葉状アクチン重合率の決定 葉状アクチン重合速度を決定する、EGFP タグ β-アクチン、B16 F1 セルを transfect photobleach 葉状地域 (ステップ 5.9) は 1.5 秒間隔と 500 ms GFP 露出して。 久万, で Visiview から取得したコマ撮り映画を開き、使用目的に従ってピクセル/μ m 比を調整、「メジャー |距離を調整」ツールです。 コマ撮りムービーを再生し、後方に流れる線としてラメラに向かって、葉状の蛍光回復がラメラに到達し、さらに後方の流れを追跡できるときフレームにそれを停止します。 Μ m、lamellipodium の先端と回復した蛍光の背面との間の距離を測定します。この距離は、逆行の流れと突起の距離の合計に相当します。 また、逆行性の流れから突起を分離する変質する前にラインの 1 つのフレームで葉状の先端をマークします。行の参照としてポイント フォトブリーチング; 時 lamellipodium 先端の元の位置を参照する後続のフレーム使用突起の距離と逆行性を測定する基準点を使用できます。 発生する退色後蛍光回復に必要な時間 (単位は秒) を注意してください。時間がフレーム レートから手動で計算するか、久万を可視化した、”メジャー |領域測定」ツールです。 (8.4 と 8.6 の手順から久万測定に基づくいくつかの方程式のパラメーター) に次の式を使用してアクチン重合速度を派生させます。   方程式 6どこアクチン重合率は μ m/分で、逆行性距離は μ m で、葉状突起の距離は、μ m、時間は秒単位。 9. タンパク質拡散と光に移動の解析 メモ: ここで紹介した方法は、可視化と細胞質内タンパク質拡散過程の定量化に示すように、PA-GFP を融合したアクチンの photoactivation を用いたアクチン単量体移動の分析を示します。 ゾル性細胞質領域として葉状領域内で蓄積から活性型アクチンの拡散を測定、次の地域で時間をかけて強度を決定する久万を使用 (図 3に示す、): 細胞内センサー領域 (PA);葉状の地域、どのセンサー蛋白質 (ラム); 時間をかけて蓄積を見込んでいます(うち) 背景の蛍光性の正規化に使用される細胞外領域。 アクチンは細胞質内での流動性を判断するには、(図 3に、領域 R1 R5 を参照) のゾル性細胞質領域を測定します。フォトブリーチング買収を起動時に焦点 – および最終的に細胞全体の蛍光性の増加のためにたたきと同様の方法で特定できないことに注意してください。 7.4 の手順で説明するように、すべての地域の強度値を Excel のスプレッドシートに久万から転送します。 Photoactivation のゾル性細胞質領域や定款 (0 時ゾル性細胞質センサー領域のパーセントの強度として表される両方) 葉状領域内の速度から活性型アクチンの変位率を調べる、ステップ 9.3 のデータから蛍光曲線を生成します。次の式が適用されます。   方程式 7   方程式 8場所: PATnは次の photoactivation; 興味の各フレームのゾル性細胞質センサー領域の強度ラムTnは次の photoactivation; 興味の各フレームの葉状部強度です。Tnうちは興味の各フレームに対応するセル (背景) の外部にある領域の強度以下 photoactivation;PAT-1は photoactivation; 前に細胞内センサー領域の強度ラムT-1は photoactivation; 前に葉状部強度です。T-1は photoactivation。 前に、のセル (背景) の外部にある領域の強度PAT0はゾル性細胞質センサー領域の強度時間 0 (すなわち、最初のフレーム photoactivation 後);T0は 0 (すなわち、最初の photoactivation 後フレーム) の時点 (背景) セルの外部にある領域の強度。 必要に応じて、データのより良い視覚化のためには、後続の各フレームから photoactivation 後最初のフレームの強度を引いて 0 強度曲線を正規化します。メモ: 次の分析メソッド (手順 9.6-9.8) も細胞質内センサー アクチンの細胞内の分散を計算できます。 連続的に賦活部位から遠位配置されているゾル性細胞質領域の強度を測定します。 時 0 にセンサー領域のパーセントの強度としてこれらの地域の強度を表す、方程式 8、葉状強度の強度と各のゾル性細胞質の ROI を置き換えられますを適用します。サイズと地域の数は、測定するセル サイズと飛散距離によって異なります。 センサー蛋白質のゾル性細胞質地域ごとの浸潤率の定量値を算出、シグマ プロット (セクション 7 で FRAP 解析に類似) に時間と各地域の蛍光強度が増加曲線の値を貼り付け、を使用するには2 方程式方程式 4プラトーに達することの蛍光強度の半分時間を導出します。異なる実験グループの間 t1/2の値を比較します。