JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

Published: May 12, 2018
doi:
10.3791/57643
,
1Division of Molecular Cell Biology, Zoological Institute,Technische Universität Braunschweig, 2Department of Cell Biology,Helmholtz Centre for Infection Research

Summary

נתאר כמה מיקרו – photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

Abstract

בחינת הדינאמיקה ייתכן של חלבונים יכול לחשוף שלהם חשיבות תפקודית בהקשרים שונים. במאמר זה, זה דנו כיצד פלורסנט התאוששות לאחר photobleaching (FRAP) וטכניקות photoactivation יכול לשמש כדי ללמוד את הדינמיקה ייתכן של חלבונים במקומות subcellular. אנו גם מראים כמה טכניקות אלה מאפשרים קביעה ישירה של פרמטרים שונים מקושר תנועתיות תקנה ותא cytoskeletal אקטין. יתר על כן, microinjection של תאים בנוסף מתואר כטיפול חלופי (פוטנציאל הקודם או משלימים את הטכניקות הנ ל photomanipulation) על ההדק השלכות מיידי של חלבונים translocated על התא מורפולוגיה ותפקוד. חוץ-גופית כגון הזרקת חלבון או יישום מקומי של קרום פלזמה-חדיר סמים או מעכבי cytoskeletal יכול לשמש כלי רב עוצמה כדי לתעד את התוצאות מיידית של טיפול נתון על התנהגות תא התא הבודד, subcellular רמה. דוגמה לכך הוא כאן על ידי אינדוקציה מיידית של lamellipodial תא קצה בליטה על ידי ההזרקה של חלבון רקומביננטי Rac1, כפי שנקבעו לפני הרבעון-מאה שנה. בנוסף, אנו מספקים פרוטוקול לקביעת המחזור של חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) משופרת-VASP, פולימראז נימה אקטין בצורה בולטת צבירת-טיפים lamellipodial של תאים B16-F1, העסקת FRAP, כולל נתונים משויכים ניתוח, פריסטלטיות. אנו מציגים גם הנחיות להערכת שיעור של lamellipodial אקטין רשת פלמור, כפי שהודגם על ידי תאים ביטוי מתויג EGFP β-אקטין. לבסוף, ניתנות הוראות כיצד לחקור את המחירים של אקטין מונומר ניידות בתוך הציטופלסמה תא, ואחריו התאגדות אקטין באתרים של פילמנט מהירה הרכבה, כגון קצות בולטות lamellipodia, באמצעות photoactivation גישות. אף אחד פרוטוקולים אלה מוגבל לשימוש ברכיבים או הרגולטורים של שלד התא אקטין, אך ניתן להרחיב בקלות לחקור מקביל אופנה הדינמיקות ייתכן והתפקוד של חלבונים במבנים שונים subcellular שונים או פונקציונלי הקשרים.

Introduction

פיקוח על הדינמיקה ייתכן של חלבונים ומולקולות אחרות בתאים חיים הפך להיות כלי חיוני בתחומים רבים של התא וביולוגיה מולקולרית. מתקדמת קרינה פלואורסצנטית טכניקות במיקרוסקופ כולל העברת האנרגיה של תהודה קרינה פלואורסצנטית (סריג) ואורך חיים סריג-זריחה הדמיה (סריג-FLIM), או לאפשר FRAP, אובדן זריחה photobleaching (היפוך), photoactivation, כמו גם רבים אחרים כדי להפוך את זמני המרחבי מעקב של אינטראקציות חלבון-חלבון, שינויים הסתגלותי, וכן לקבוע את קינטיקה של דיפוזיה ולוקליזציה של חלבונים שונים בתא1,2. טכניקות FRAP, photoactivation, בפרט, הינם חלים נרחב לבחינת הרגולטורים של אקטין שלד התא והתא ההעברה. שיטות אלה ניתן להחיל לבד או בשילוב עם טכניקות המיקרומניפולציה נוספים כגון microinjection3, ולערב הביטוי של חלבונים עם התווית fluorescently. הם מאפשרים את אומדן קינטיקה של התאחדות החלבון אקטין-עשיר מבנים מעורב נדידת תאים, כגון filopodia או lamellipodia, המחזור של חלבונים הדבקויות מוקד4, או בענף רשתות אקטין5. בנוסף, הם מאפשרים קביעת המחירים פלמור אקטין lamellipodial, ההערכה של הפיזור של אקטין monomeric בתוך ציטוזול, הקצב של טרנסלוקציה מונומר אקטין subcellular כדי polymerizing אקטין חוטים ב בולטות lamellipodia6, ופרמטרים אחרים.

FRAP היא שיטת להמחיש וכימות הניידות של חלבונים בתוך התא החי, פותח במקור בשנות ה-70 על ידי אקסלרוד7. אזור בעל עניין (ROI) בתוך תא, מאוכלס שכותרתו fluorescently חלבונים, transiently חשופים לייזר בעוצמה גבוהה, מספיק כדי לגרום את הלבנה של מולקולות fluorophore נוכח באזור זה במשך תקופה קצרה נתון של זמן. מולבן, fluorescently עם התווית חלבונים הממוקם מחוץ רועי במהלך הלבנה, מפוזר, לחדור לאזור מולבן בהתאם דינמיקה ייתכן שלהם, גורמת העקירה של מולקולות photobleached לאורך זמן. הקצב של קרינה פלואורסצנטית שחזור באזורים מולבן תלויה גורמים שונים, כולל את הגודל ואת קצב פעפוע של מולקולה נתונה, ומקושרת כמובן קצב תחלופת שלה בתוך בשם מבנה מולבן. לכן, חלבונים מסיסים לתווך את ההתאוששות של קרינה פלואורסצנטית בתוך רועי מולבן במהירות באמצעות דיפוזיה, בעוד חלבונים הקשורים בחוזקה עם מבנים, כגון הדבקויות מוקד, יהיו פעמים מחזור ארוך יותר, כמו להחלמתם קרינה פלואורסצנטית מותנה על פעפוע של השבר מסיסים של קינטיקה חלבון, דיסוציאציה-עמותה של השבר מבנה-הקשורים. קרינה פלואורסצנטית התאוששות בדרך כלל רכשה, לכמת עד הרמה הראשונית של אקונומיקה קדם עוצמת קרינה פלואורסצנטית. עם זאת, זו אינה מתרחשת אם חלק עוצמת קרינה פלואורסצנטית הראשונית שייך השבר משותק כביכול, אשר אינו מסוגל המיועדים לחידוש מלאי על ידי דיפוזיה או הוא חידוש בקצב מאוד איטי לעומת רוב מולקולות הכוללת הנייד שבר. כדי לקבוע את קצב תחלופת חלבון, עקומות FRAP נוצרים, המייצג את היקף פלורסצנטיות שחזור לאורך זמן. מפני עיקולים אלה השחזור, ניתן לחשב ממוצע חצי-פעמים של חלבון התאוששות. על-ידי יצירת העקומה מתאימה של נתונים FRAP הממוצע, וכן ניתוחים מתמטיים ולכן, זה גם אפשרי להסיק קצב תחלופת הממוצע של השבר הנייד מהווה שילוב של אוכלוסייה הומוגנית אחת של מולקולות, או הוא מורכב subpopulations שתיים או יותר של מולקולות מתהפך במחירים דיפרנציאלית. בנוסף להערכת חלבון מחזור המחירים על ידי גישות כמותית, מעקב ההתאוששות של אזורים photobleached lamellipodia יכול גם לאפשר על כימות מדויק של lamellipodial פרמטרים תנועתיות כגון זרימת רטרוגרדית, בליטה, המחירים פלמור אקטין. לפיכך, FRAP מהווה כלי רב-תכליתי שתחול עבור הערכת פרמטרים שונים בתוך מבנים של תאים חיים.

Photoactivation היא שיטה המשמש למעקב אחר של דיפוזיה וניידות של חלבונים או מולקולות שמקורן במיקום סלולרי ייעודי. הטכניקה מעסיקה, למשל, וריאציה של פראי-סוג חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), שפותחה לראשונה על ידי פטרסון, Lippincott-שוורץ8, אשר הוא מוטציה באופן המאפשר פלורסצנטיות שלה צריך להיות מוגברת מאוד בתגובה לחשיפה אולטרה סגול (UV) אור (כ- 400 ננומטר; כאן, 405 ננומטר). כפי שתואר על ידי פטרסון et al., פראי-סוג GFP בראשון קיימים אוכלוסייה מעורבת של פנולים נייטרלי, phenolates anionic, אשר מייצרים לשיא ספיגת הגדולות כ 397 nm ו סופה קטנה-475 nm, בהתאמה. על הקרנה של החלבון עם אור UV, האוכלוסייה עובר photoconversion, הנעה כלפי הצורה anionic. כשהוא מתרגש על ידי 488 ננומטר, החלבון photoconverted/photoactivated מציג עלייה 3-fold פלורסצנטיות, מספיקות בפועל הבחנה בין מופעל, שלא הופעל GFP עקב קרינה פלואורסצנטית רקע פנימי גבוה. עם זאת, ירידה בעוצמת רקע הושגה על ידי החדרת מוטציה בודדת חומצת אמינו לתוך הרצף GFP (החלפת היסטידין במיקום 203). וכתוצאה מכך T203H החשבונאי, ידוע גם בשם photoactivatable-GFP (PA-GFP) מאופיין על ידי ירידה משמעותית ספיגת השיא קטין, אשר על הקרנה עם אור UV הוא גדל כמעט 100-fold כשהוא מתרגש לאחר מכן על ידי אור 488 ננומטר. ומכאן, ביטוי של חלבונים הרשות הפלסטינית-GFP-מתויגים ‘ הוא בגישה בשימוש נרחב, המאפשר קביעת דיפוזיה, תנועתיות של מולקולות בתוך התאים. אנחנו החלת בעבר הרשות הפלסטינית-GFP-מתויגים ‘ אקטין כדי לקבוע את הקצב של פיזור של מונומרים של אקטין מן האזורים cytosolic, ומאפשר לא רק חקר ניידותו בתוך את ציטוזול, אלא גם שיעור התאגדות שלהם לתוך בולטות אקטין lamellipodial רשת6. ספרות עדכנית יותר מתאר גם חלבונים הרומן, צילום-להמרה באופן עקרוני ניתן להשתמש באופן מקביל, אך מסתירים את הפוטנציאל הגלום יהיה גלוי כבר לפני צילום-המרה. עבור קבוצה זו של חלבונים פלורסנט דוגמאות Dendra2 ו- mEos29,10,11,12.

במאמר זה, נסביר את המתודולוגיה של תאים microinjecting עם חלבונים. בהמשך נסביר איך טכניקה זו יכול להיות משולב עם FRAP, מאת photobleaching החלבונים המעורבים אקטין שלד התא רגולציה, תנועתיות, ו כיצד ניתן לגזור FRAP ופיתולים בחצי משרה של התאוששות של שברים ניידים. בנוסף, אנו מספקים דוגמא של איך הטכניקה FRAP יכול לשמש כדי לקבוע שיעור פלמור אקטין של רשתות lamellipodial. אנו מספקים גם הנחיות וטיפים על איך לבצע ניסויים photoactivation, אשר יכול לשמש כדי לקבוע cytosolic הניידות של אקטין monomeric ואת המחירים של אקטין השתלבות lamellipodia. שיטות אלה, כמובן, אינם רק מוגבל של מעקב אחר רכיבי שלד התא אקטין, אבל עם פוטנציאל נדרש התאקלמות מתון או אופטימיזציה, יכול להיות מיושם באופן נרחב כדי סוגי תאים אחרים או לחקור חלבונים שונים, מבנים, ו פרמטרים.

Protocol

1. Coverslip כביסה, סטריליזציה לטבול משקפיים מכסה 15 מ מ (קוטר) (מס ‘ 1) בבקבוקון 500 מ”ל המכיל תערובת של 40 מ ל 37% HCl ו- 60 מ ל 100% EtOH (לא יותר מ-100 coverslips לכל 100 מ ל שטיפה פתרון).הערה: גם אם טרי שנרכשו, coverslips יש והטכני לנקות לפני זריעה תאים על משטחי שלהם. זה כי הם עשויים להכיל סרטים רזה של גריז, הן בלתי נראות בעין בלתי מזוינת, אך יכולים להפריע ביעילות אדהזיה והפצת המתאים של תאים חיים. ואילו סרטים כאלה ניתן להסיר ביעילות עם פתרונות המכיל חומצה או בסיס (ראה פישר. et al. 13), אנו משתמשים באופן שגרתי את התערובת חומצה/אלכוהול שתוארו לעיל. לנער את הבקבוק המכיל את המשקפיים מכסה במשך 30 דקות על סיבוב מטרף. בחר מהירות המאפשר את המשקפיים כיסוי להיות התרוצצו בחופשיות, אך איטי מספיק כדי למנוע שבירת בתדירות גבוהה. Filtrate הפתרון כדי להסיר חתיכות זכוכית שבורה אם שימוש חוזר. להעביר את המשקפיים כיסוי בקבוקון המכיל לפחות 200 מ ל מים סטריליים, דגירה על סיבוב מטרף, תוך כדי החלפת שוב ושוב את המים עד חומצי הריח נעלם. מנקי מרובים על פני מספר שעות מומלץ עבור חיסול מוחלט של HCL-EtOH עקבות. יבש בודדות המשקפיים כיסוי על גליון נייר סינון. המקום המשקפיים כיסוי בתחתית צלחת פטרי 10 ס מ (קוטר) מכוסה נייר סינון, ואת חום יבש-לעקר. הימנע autoclaving כמו זה יגרום כיסוי משקפיים להישאר ביחד. 2. טיפול של תאים, תרביות תאים, זריעה על Coverslips לגדול B16-F1 העכבר בתאי מלנומה בהתאם לתנאים של תרבות תא סטנדרטי ב- DMEM (גלוקוז 4.5 g/L) המכיל 10% עגל עוברית סרום, גלוטמין 2 מ מ ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב 37 מעלות צלזיוס, 7% CO2. לגדל תאי פיברובלסט NIH3T3 עבור microinjections בהתאם לתנאים תרבות רגיל תא (חממה תרביות רקמה ב 37 מעלות צלזיוס, 7% CO2) DMEM (גלוקוז 4.5 g/L) המכיל 10% עוברית שור סרום, 1 מ מ נתרן פירובט, חומצות אמינו שאינן הכרחיות MEM x 1 , גלוטמין 2 מ מ, ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. עבור transfections, לגדול B16-F1 תאים זרימה 100% צלחת 10 ס מ, מעבר ביחס של 1:5 לתוך צלחת פלסטיק 3 ס מ (קוטר). באותו יום, לאחר התאים B16-F1 הורשו לדבוק במשך לפחות 6 שעות, transfect עם 500 ng/צלחת של photoactivatable הרשות הפלסטינית-GFP-אקטין או מתויג EGFP β-אקטין פלסמיד ה-DNA. עבור transfections משותף של הרשות הפלסטינית-GFP-אקטין עם קידוד mCherry וקטורים, מערבבים סך של 1 µg של פלסמיד דנ א לכל צלחת 3 ס מ. Transfect התאים B16-F1 עם תרביות תאים הכימית (טבלה של חומרים). עבור תבשיל 3 ס מ, לערבב 200 µL של 150 מ מ NaCl המכיל 500 ננוגרם של ה-DNA לבנות עם 200 µL של 150 מ מ NaCl המכיל 1 µL של תרביות תאים ריאגנט (קרי, דנ א (µg): ריאגנט (µL) יחס של 1:2 שימש). דגירה התערובת תקנים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT), pipet drop-wise על המנה 3 ס מ המכילות את התאים. מה עוללת בעדינות את המנה כדי לערבב דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 7% CO2 הכנת המאגר ציפוי laminin המכיל 50 מ”מ טריס, pH 7.4 ו- 150 מ מ NaCl. עבור התאים B16-F1, מעיל משקפיים מכסה 15 מ מ על ידי הפצת µL 150 של laminin (25 µg/mL במאגר ציפוי laminin) ואת תקופת דגירה של h 1-RT. תאי NIH3T3, מעיל המשקפיים כיסוי עם פתרון fibronectin (25 µg/mL בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS)) ועל תקופת דגירה של h 1-RT. לשטוף כוסות כיסוי מודגרות laminin או fibronectin עם PBS, ואז האחות של PBS ולהוסיף 2 מ”ל של תאים transfected. זרע התאים B16-F1 transfected (ב- 1:30 יחס מתוך קערה confluent), ביום שאחרי תרביות תאים, על coverslips laminin מצופים. זרע את fibroblasts NIH3T3 (ב- 1:20 יחס מתוך קערה confluent) על coverslips מצופים fibronectin. לאפשר את התאים להפיץ laminin או fibronectin-מצופים משקפיים כיסוי לילה בחממה תרביות רקמה ב 37 מעלות צלזיוס לפני מיקרוסקופ. לחלופין, ניתן לאתחל מיקרוסקופ ניסויים באותו היום, בהתחשב בכך תאים מותר להפיץ לפחות 2-3 h. 3. הרכבה של מיקרוסקופיית הדמיה קאמרית השתמש של חום מוליך RC-26 אלומיניום הדמיה תא מיקרוסקופ (איור 1). למרוח את המשחה סיליקון מסביב קווי המתאר של הפתח סילר לאיטום פלסטיק באמצעות מזרק (איור 1b). במקום הזכוכית המכסה תאי הצד מעלה על החדר (איור 1c). במקום חותם פלסטיק על גבי הזכוכית המכסה כדי להפוך גושפנקה מאובטח בין coverslip את החדר. לתקן חותם פלסטיק (באלכסון כדי למנוע שבירה coverslip) על-ידי דופק את התפסים הזזה על הלשכה להימנע המדיום דולף (איור 1d). פיפטה 37 ° C בינוני מיקרוסקופ מחומם מראש לתוך האזור המרכזי. עבור מדיום מופחת ב- autofluorescence, ובכך אופטימיזציה עבור מיקרוסקופ, להשתמש המתכון אותו כמו תרבות בינוני שתוארו לעיל, אך עם F12-חזיר במקום DMEM, בנוסף המכילה 20 מ מ HEPES culturing של תאים, בהעדר CO2 (איור 1e). הוסף את גלאי חום לחריץ הייעודי של התא וקשר האלקטרודות של התא על בקר טמפרטורה אוטומטית TC-324B שמירה על טמפרטורת חום קבועה של 37 ° C (איור 1f). מקום טיפה קטנה של שמן טבילה המטרה ולמקם לחדר על גבי. דגירה התא עם תאים לפחות 10 – 30 דקות לאפשר להם כדי לשחזר ירידת טמפרטורה במהלך הרכבה, להסתגל למדיום מיקרוסקופ. לפני מיקרוסקופ מאותחלת, החלף את המדיום תרבות בתוך המאגר המרכזי של התא (בערך 800 µL) כדי למנוע ריכוז לא הולם של הרכיבים בינוני, סרום בשל התאיידות בינוני. להפעלות מיקרוסקופיית ממושך עם צ’יימברס פתוח ידרוש שינוי שגרתית של המדיום אידוי. 4. microinjection השגרה מעיל על coverslips, להכין את התאים, ולהרכיב לחדר ההדמיה כפי שתואר לעיל. להפשיר את aliquot של חלבון מטוהרים כדי להיות מוזרק (בדרך כלל 10 µL או פחות), לדלל את זה עם המאגר המתאים microinjection.הערה: מאגר הרכב אולי משתנים לפי סוג חלבון ותא, אבל לטפל כדי להשתמש pH בין 6.95 8.00 וכדי להימנע משימוש PBS, כמו רוב התאים לא להיות מוזרק עם PBS. עבור Rac1 microinjection, להכין מאגר המכיל 100 מ מ NaCl, 50 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 5 מ מ MgCl2, 1 מ”מ DTT. היונים2 + Mg חיוניים ליציבות GTPase קטן.הערה: ריכוז חלבון בדרך כלל משתנות בין 0.1-1 mg/mL (מקסימום 2 מ”ג/מ”ל), בהתאם החלבון, סוג של ניסוי, ותא להקליד. אם רלוונטי, להוסיף הפלורסנט, כגון לתוספי אינרטי (0.5 µg/mL, 70 kDa) הפתרון חלבון, אשר יכול לאשר הנוכחות של המחט זרימה לפני זריקות וההיתרים התיעוד של זריקות מוצלח לאחר הניסוי.הערה: הניסוי כאן אינו מכוון בעקבות הדינמיקה של Rac1 מוזרק, אשר יהיה אפשרי על ידי קרינה פלואורסצנטית ישירה תיוג של החלבון. צימוד של חלבונים עם צבעי פלורסנט או היתוך כדי החלבון הניאון הוא אפשרי, אך נמנעה כאן כמו זה בנמלים הסיכון מתנגש עם הפונקציה איתות, במיוחד של חלבונים קטנים כמו GTPase Rac1 רו-משפחה (20 kDa). Centrifuge הפתרון חלבון ב g x 10,000 במשך לפחות 30 דקות להוציא אגרגטים חלבון זה יכול להוביל מחט סתימת אם נוכח microinjection נימי. לטעון מחט microinjection (נימי microinjection) עם µL 1 של הזרקת תערובת מהצד האחורי באמצעות טיפ טיפ/microloader פיפטה גמיש. בועות אוויר הנמצאות בקצה המחט, טפח בעדינות על הבסיס מחט כדי להסיר אותם. המשך במהירות כדי למנוע ייבוש של קצה המחט, אשר יכול לגרום סתימת המחט. בזהירות להתאים למחזיק המחט על המכשיר המיקרומניפולציה. אם באמצעות מיקרוסקופ הפוך עבור הדמיה ניגודיות שלב, לפני ההעמסה מחט, להבטיח יש מספיק מקום כדי להזיז את המחט למעלה ולמטה ללא הפרעה מעבה את המיקרוסקופ. על דופק את microcapillary על גבי למחזיק המחט, הפעילו לחץ (20 – 50 hPa רקע לחץ) לבין המחט באמצעות מכשיר לחץ microinjection לפני translocating את מחט לתוך התרבות התא האמצעי.הערה: הפעלת הלחץ שהמחט נמצאת בתוך המדיום התוצאה המדיום להיות מתחנף בכוח נימי, ובכך מנע הזרקה של הפתרון של ריבית. מקם את המחט בתוך שדה הראייה (בהנחייתם באמצעות הגדלה נמוכה מטרות). יעד 40 X יבש לניסויים microinjection שימש כאן. מקם את מחט בעין בלתי מזוינת בצורה מאונכת ביחס באמצע של העדשה אובייקטיבי (זה יאיץ למצוא את מחט). השתמש המיקרוסקופ עם אופטיקה חדות שלב כדי להזיז מחט ב מישור אופקי ביחס שדה הראיה, על מטוס אופטי טוב-מעל השכבה תא.הערה: המחט יופיע בתחילה כצל של שדה הראייה, והוא אז יכול להיות מותאם המטוס המוקד כדי להמחיש את הטיפ. ברגע קצה המחט נמצא, בהדרגה להפחית את המטוס אופטי ואחריו קצה המחט אל עמדה קרוב שכבת תאים. לבדוק את זרם המחט על ידי מיתוג לערוץ פלורסנט בעת שימוש לתוספי פלורסנט, לכוון את זרימת באמצעות המכשיר לחץ כדי להשיג זרם קבוע “רקע”.הערה: במאמר זה, אנו מתארים הזרקה ידנית, אשר מתווך על ידי פורצים דרך קרום פלזמה באמצעות נגיעה התא על פני השטח ועדינים תנועה של קצה המחט במהלך זרימה מתמדת מחט. זה יש להבחין בין הזרקת באופן אוטומטי התקנים בליווי המחט מתוכנת הורדת ואת המחט לחץ להגדיל במהלך האירועים בהזרקה, אשר מתאימים יותר עבור ההזרקה של מספרי הטלפון הנייד גבוה יותר ואחריו אוכלוסיה תא מאוחר יותר ניתוח. השיטה המתוארת כאן ממוטבים לניתוח תא בודד על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות לפני, במהלך, ואחרי microinjection. למצוא תא של ריבית, להפחית בהדרגה את המחט שמעל לתא. כאשר מוכנים microinject, להנמיך את המחט בהדרגה לעבר האזור perinuclear תא באמצעות את pinion בסדר של הג ‘ ויסטיק micromanipulator, תוך שמירה על התאים בפוקוס. עבור microinjection, לגעת בעדינות קרום הפלזמה של התא, אשר עשוי להספיק כדי לחדור לתא, או לסייע קרע ממברנה ארעי על ידי ציטוט עדין מאוד על ההגדרה של מיקרוסקופ.הערה: נקודה לבנה בקצה המחט יציין את הזמן של מגע עם קרום פלזמה; בעקבות קרע ממברנה, קצה המחט reseal, בליווי זרם עדין של פתרון הזרקה לתוך התא. לעצור את התהליך הזרקת ברגע זרימה לתוך התא יהיה גלוי (אידיאלי במרחק 0.3 s) על-ידי הזזת את קצה המחט לתוך האמצעי. בעת שימוש לתוספי פלורסנט, זריקות מוצלחות מתועד באופן מיידי על-ידי קרינה פלואורסצנטית. אם רצונך בכך, ליזום ייבוא תמונות בצילום מואץ לפני או אחרי microinjection.הערה: יישום מקומי של תרופות או מעכבי שניתן לבצע על כל השלבים כאן, פרט microinjection אירוע לכשעצמו. עבור יישומים מקומיים, פעפוע של המולקולה הפעילה יכול להיות נשלט על ידי לחץ זרימה, שתועד על-ידי קרינה פלואורסצנטית, קצה המחט יכולים למקם בגובה הרצוי. לקבלת דוגמאות לניסויים הבקשה המקומית, ראה למשל, קטן, Rottner14 או. Kaverina et al. 15 בעקבות microinjection, המתן עד השפעת החלבון מתרחשת. חלבונים שונים, בהתאם לתוצאה הצפויה, דגירה פעמים עשויים להשתנות. עבור Rac1 קטן GTPase, התגובה של היווצרות lamellipodium יכול להיות יזם בתוך 1 דקות או פחות, אבל לוקח כ 10-15 דקות בממוצע כדי להתפתח לגמרי (איור 1g, h). לשפוט את הכדאיות של תאים בעקבות את microinjection.הערה: זריקות נאותה או מזיקה יכול לגרום נזק לתאים, אשר פעמים רבות מלווה שאינם ספציפיים תא שפת הכחשה או קרע קרום פלזמה. הימנע מציץ דרך החלק העליון והחלק התחתון קרום פלזמה, אשר עשויה להתרחש בשל זריקות אזורים שטוח הסלולר.הערה: הזרקת כרכים יש לשמור עד למינימום (אידיאלי 2 מ”ג/מ”ל עלול להפוך מעשית עקב סתימת המחט בתדירות גבוהה. עם זאת, זה תלוי גם האיכות ואת ההתנהגות של החלבון מטוהרים; למשל, הזרקה של אקטין מצמידים fluorescently הינו מסובך הפילמור תלויי-ריכוז ונמרצים להיערכותם בקצה המחט, ומבוצעת אז זה לעתים נדירות היום (ראה ואח קטן. 16). לפני, במהלך או אחרי השפעת microinjection, FRAP או photoactivation יכול להתבצע על אותו תא (ראה סעיף 5 ו- 6). 5. הליך FRAP Transfect את סוג התא עניין (תאים B16-F1 כאן) עם פלסמיד DNA קידוד חלבון מתויג fluorescently עניין (כאן, מתויג EGFP גירסה של β-אקטין שימשה). הזרע התאים על coverslips מצופים laminin (שלב 2.10). להרכיב את התא הדמיה (סעיף 3). השתמש בהגדרות הבאות עבור lamellipodial באזור photobleaching: עוצמת הלייזר 65 mW (משתנה לפי ניסיוני מקור ההתקנה ולייזר); קוטר הקרן לייזר פיקסל 10; ms אקונומיקה להתעכב זמן/פיקסל; זמן החשיפה של GFP 500 ms; מרווח זמן 1,500 ms. תוצאות ניסויית נייר זה בוצעו עם objective apochromatic 100 X 1.4NA. לבצע כיול לייזר כדי להבטיח דיוק את הממדים של האזור photobleached. לפני הכיול, העברת שדה הראייה לאזור חסר כל אות תאים/זריחה ולבחון את התמונה בתצוגה. בחר את רמת ההגדלה אובייקטיבית על-ידי לחיצה על לחצן הגדלה בהתאמה, להפחית את עוצמת הלייזר (mW 3-5) “לוח | תפריט בעוצמה”. ליזום כיול ידני על תוכנת Visiview (v2.1.4), בחר “קביעת תצורה | FRAP”תפריט, לחץ על” כיול | תפריט להתאים ידנית”. ודא כי ניתן להבחין הלייזר בתור נקודה חדה. אם לא, למקד מחדש או להתאים את החומרה לייזר. לבצע את הכיול באמצעות ידנית הנחיית הלייזר אל נקודות ציון שנקבע מראש התוכנה X-Y. זה מנחה התוכנה לאופן הפילוח במיוחד הלייזר אזור על-ידי המשתמש עבור ההגדלה הנוכחית. לפני מפעילה את הלייזר, לעבור ערוץ ה-GFP, ליזום תמונה/זמן לשגות רכישה. לצייר באופן ידני את האזור להיות photobleached בערוץ ה-GFP, תוך הצגת התצוגה. ליזום photobleaching על ידי מפעיל ידני של 405 ננומטר לייזר, לפחות 3-4 מסגרות לאחר החניכה של ייבוא תמונות. רכישת מסגרות לפני photobleaching נדרש עבור נורמליזציה של התמונה בניתוח הנתונים מאוחר יותר. 6. נוהל Photoactivation הערה: התוכנה, מיקרוסקופ ההתקנה והגדרות, למעט הסמכות לייזר, דומים לאלה של FRAP. ב- photoactivation, הבדל חשוב לעומת FRAP, זה לייזר 405nm כוח נמוך משמעותית מאשר המועסקים על photobleaching יש להשתמש, כדי להפעיל את הרשות הפלסטינית-GFP ללא בו זמנית photobleaching זה. שיתוף transfect את סוג התא עניין (B16-F1 תאים כאן; ראה שלב 2.5) עם ה-DNA פלסמיד קידוד הרשות הפלסטינית-GFP-אקטין, עוד חלבון הנקרא fluorescently (למשל, mCherry או mCherry-Lifeact).הערה: ברוב המקרים, תאים mCherry-חיוביות גם יהיה חיובי עבור וקטור הרשות הפלסטינית-GFP-אקטין, בדרך כלל לא ראיתי בערוץ ה-GFP לפני photoactivation האחרון. כדי לשפר את הסיכוי כי התאים mCherry-חיוביים הם גם חיובי עבור הרשות הפלסטינית-GFP, השתמש יחס 1:2 תרביות תאים של mCherry:PA-GFP-אקטין. בעקבות זה פרוטוקול, למעלה מ-90% של התאים לבטא mCherry מוצגים הפעלה מוצלחת של הרשות הפלסטינית-GFP-אקטין. תאי זרע B16-F1 על coverslips מצופים laminin (שלב 2.10). להרכיב את התא הדמיה (סעיף 3). לפני ביצוע הניסויים photoactivation, במידת הצורך, לבצע את הכיול לייזר עבור המטרה שנבחרה (שלב 5.4-5.6). הגדר את רכישת התמונה GFP/488 ננומטר 500 ms חשיפה ו- 1,500 ms מרווח זמן (בהתאם לעיצוב הניסיונית). התאם את הגדרות תוכנה לרכישת ערוץ כפול או משולש-ערוץ סרטים בצילום מואץ על ידי סימון הריבוע “גל סדרה” ובחירת מספר ערוצים הרצוי “רכוש | תפריט גל’. מומלץ לקולנוע זמן לשגות נרכשים עם ניגודיות שלב וערוצי GFP. באופן אופציונלי, כוללים גם את הערוץ mCherry; עם זאת, חשיפת תאים עם אור מדי עלול לגרום נזקי. זה יוכלו להימנע עם חמצן הנבלות כגון Oxyrase17, למרות טיפול יעיל דורש תא קאמרית איטום. למצוא את התאים transfected בערוץ mCherry. לפני מפעילה את הלייזר, ליזום תמונה/זמן לשגות רכישת וצייר באופן ידני את האזור להיות photoactivated בערוץ ניגודיות שלב, תוך כדי צפייה בתצוגה. ליזום photoactivation על ידי מפעיל ידני 405 ננומטר לייזר (עוצמת הממוקם בין 5-15 mW “לוח | תפריט בעוצמה”), לפחות 3-4 מסגרות לאחר החניכה רכישת התמונה. 7. נתוני ניתוח והצגת תוצאות FRAP הערה: השיטה המובאת משמש עבור חוקרים המחזור של חלבון צבירת באתרים של הרכבה דינמית אקטין, במקרה זה VASP, אשר משייכת אדהזיה אתרים, קצות בולטות lamellipodia. אנחנו מנתחים את המחזור בקצה lamellipodium, אבל אותם עקרונות של ניתוח יכול להיות מיושם על חקירת המחזור של VASP או כל חלבון אחרים, תאים subcellular אחרים. פתח את הסרטים זמן לשגות נגזר Visiview על התוכנה Metamorph. במאמר זה, שימש Metamorph v7.8.10. לגזור ערכי העוצמה עבור אזורים photobleached באמצעות ידנית חלוקה לאזורים המתאימים ב- Metamorph. לצייר צורה בקצה lamellipodium מכסה את כל או חלק של אזור photobleached, ולא להתאים ידנית את מיקומו על המסגרות במידת הצורך (קרי, אם הקצה בולטת), ב סדר כדי לעקוב אחר שינויים ב- lamellipodial עוצמות הרכיב בהתאמה במהלך העקירה עצה. עבור תיקון של רקע ורכישת photobleaching, לנתח אזורים בתוך והן מחוץ לתא. ראה איור 2 עבור אזורים נציג של עוצמות נמדד. כאשר רועי נבחרה, לחלץ את ערכי העוצמה שלה על Metamorph באמצעות התפריט “מדד | אזור מדידות”. ודא נבחרו האפשרויות “זמן שחלף” ועוצמה “ממוצע” בתפריט “הגדרת”. לחץ על “יומן פתוח” ובחר “חילופי מידע דינאמיים”. לחץ על “אישור” כדי לפתוח את גיליון אלקטרוני של Excel, ולחץ על הלחצן “לפתוח יומן” שוב כדי להדביק את הערכים Metamorph לתוך Excel.הערה: ערכים אלה משמשים להפקת העקומות שחזור זריחה. ליצירת עקומות שחזור פלורסצנטיות בקצה lamellipodium של אזורים photobleached (מנורמל עוצמת באזור לפני photobleaching), החל המשוואה הבאה:   משוואה 1איפה: FRAPTn הוא עוצמת אזור photobleached לכל אחת מהמסגרות עניין בעקבות photobleaching; בחוץTn עוצמת אזור נלקח מחוץ לתא (רקע) לכל אחת מהמסגרות עניין עוקב photobleaching; תוספותTn הוא שני בממוצע בתוך אזור עוצמות לכל אחת מהמסגרות עניין בעקבות photobleaching (משמש כדי לנרמל עבור רכישת photobleaching לאורך זמן); FRAPT-1 זה את העוצמה באזור photobleached לפני photobleaching; T-1 הוא בעוצמה האזור נלקח מחוץ לתא (רקע) לפני photobleaching; תוספותT-1 שניים בממוצע בתוך אזור עוצמות לכל אחת מהמסגרות עניין לפני photobleaching. לכל מסגרת הזמן של עניין, השתמש משוואה 1 להשגת עיקול שחזור פלורסצנטיות המכיל כל הזמן מסגרות להיחקר. משך הזמן תלוי אך ורק החלבון תחת חקירה. כאשר לא ידוע, לבצע ניסויים ראשוני כדי לרכוש את קצב תחלופת של החלבון. לחישוב המחצית של התאוששות, להדביק את הערכים של העקומה שחזור זריחה עם הזמן המקביל (בשניות) מגרש סיגמא (v.12), לבצע עיקול להתאים באמצעות “הדינאמי שיתאים אשף | כלי עלייה אקספוננציאלית למקסימום”. בחר מונו-מעריכית (יחיד, 3 פרמטרים) או דו-מעריכית (זוגי, 4 פרמטרים) פונקציות, בהתאם העקומה הכי מתאים. השתמש בנוסחה הבאה עבור מונו-אקספוננט:   משוואה 2 השתמש בנוסחה הבאה עבור פונקציה מעריכית-bi:   משוואה 3 הדבק פרמטרים “b” ו- “d” נגזר סיגמא התוויה (משוואה 2 או 3 משוואה) לתוך Excel לחישוב המחצית של התאוששות. להחיל את המשוואות הבאות:   משוואה 4או   משוואת 5 כאשר הפונקציה המעריכית-מונו יוצרת מעגל מדויק מתאים, החל רק משוואה 4. כאשר מונו-אקספוננט לגרום לא עקומה טוב מתאים, מיישם את נוסחת ה-bi-מעריכי על ידי פתירת משוואה 4 ו5 משוואה. שקול וכתוצאה מכך שני החצי-הזמנים של התאוששות כמייצג שני שברים חלבונים שונים: במהירות, שבריר החלפת לאט, בהתאמה. 8. קביעת שיעור פלמור אקטין Lamellipodial על ידי FRAP כדי לקבוע את שיעור פלמור אקטין lamellipodial, transfect B16-F1 תאים עם מתויג EGFP β-אקטין, ושימוש photobleach באזור lamellipodial (שלב 5.9) 1.5 מרווח זמן s וחשיפה GFP 500 ms. ב- Metamorph, פתח את הסרטים זמן לשגות שנרכש Visiview, לכייל את היחס פיקסל/מיקרומטר לפי המטרה בשימוש על ידי “מדד | כלי כיול המרחקים”. להפעיל את הסרט זמן לשגות, לעצור את זה על המסגרת בעת התאוששות זריחה lamellipodial, אשר זורם אחורנית לכיוון lamella כקו, הגיע את lamella והוא עוד ניתן לעקוב ובמתקן זרימה. למדוד את המרחק במיקרומטר בין קצה lamellipodium האחורי של זריחה התאושש. במרחק הזה מקביל הסכום של זרימה רטרוגרדית ומרחקים בליטה. לחלופין, כדי להפריד את בליטה של זרימה רטרוגרדית, לסמן את הטיפ lamellipodial עם קו מסגרת אחת לפני photobleaching. שימוש הקו כהפניה הצבע בתוך המסגרות הבאות כדי להפנות המיקום המקורי של קצה lamellipodium בזמנו של photobleaching; נקודת ההתייחסות ניתן למדוד את המרחק בליטה וזרימה רטרוגרדית. הערה את הזמן (בשניות) הנדרש להתאוששות פלורסצנטיות לאחר photobleaching להופיע. הפעם ניתן לחשב באופן ידני מתוך שער מסגרת או דמיינו ידי Metamorph דרך “מדד | כלי אזור מדידות”. שואבים את קצב פלמור אקטין באמצעות המשוואה הבאה (עם כמה פרמטרים למשוואה המבוסס על מידות Metamorph שלבים 8.4 ו- 8.6):   משוואת 6איפה שיעור פלמור אקטין הוא במיקרומטר/min, זרימה רטרוגרדית מרחק זה ב מיקרומטר, lamellipodial תיתכן מרחק זה ב מיקרומטר, הזמן בשניות. 9. ניתוח של חלבון דיפוזיה וניידות על Photoactivation הערה: השיטה המובאת כאן מתאר הניתוח של אקטין מונומר ניידות באמצעות שימוש photoactivation של אקטין דבוקה הרשות הפלסטינית-GFP, מאויר על ידי החזותיים כימות של חלבון דיפוזיה דרך ציטוזול. למדידת פעפוע של אקטין photoactivatable מן אזור cytosolic, כמו גם ההצטברות בתוך אזור lamellipodial, להשתמש Metamorph כדי לקבוע את עוצמת לאורך זמן, באזורים הבאים (מאויר איור 3 ): אזור cytosolic photoactivated (פי אי); אזור lamellipodial, ב photoactivated אילו חלבונים צפויים לצבור לאורך זמן (להרביץ); אזור מחוץ לתא שנמצא בשימוש עבור נרמול רקע זריחה (החוצה). בעת קביעת הניידות של אקטין בתוך ציטוזול, למדוד אזורים הנבדלים זה מזה cytosolic (ראה איור 3, אזורים R1-R5). שימו לב כי הרכישה photobleaching לא ניתן לקבוע באופן דומה כדי FRAP, מגידול פלורסצנטיות מוקד – וברחבי בסופו של דבר תא בעת ההפעלה. להעביר את ערכי העוצמה של כל האזורים Metamorph לתוך גיליון אלקטרוני של Excel, כפי שמתואר בשלב 7.4. לבחינת הקצב של תזוזה של אקטין photoactivatable על אזור cytosolic photoactivation או אחוז לצאר אזור lamellipodial (שניהם מיוצג אחוז בעוצמה של האזור cytosolic photoactivated בזמן 0) , ליצור עקומות פלורסצנטיות מן הנתונים בשלב 9.3. להחיל את המשוואות הבאות:   המשוואה 7   משוואת 8איפה: הרשות הפלסטיניתTn הוא האינטנסיביות של אזור cytosolic photoactivated לכל אחת מהמסגרות עניין בעקבות photoactivation; לאםTn הוא האינטנסיביות של אזור lamellipodial לכל אחת מהמסגרות עניין בעקבות photoactivation; בחוץTn האינטנסיביות של אזור נלקח מחוץ לתא (רקע) לכל אחת מהמסגרות עניין עוקב photoactivation; הרשות הפלסטיניתT-1 זה את העוצמה של אזור cytosolic photoactivated לפני photoactivation; לאםT-1 זה את העוצמה של אזור lamellipodial לפני photoactivation; T-1 הוא האינטנסיביות של אזור נלקח מחוץ לתא (רקע) לפני photoactivation; הרשות הפלסטיניתT0 הוא האינטנסיביות של אזור cytosolic photoactivated בזמן 0 (קרי, הפריים הראשון לאחר photoactivation); T0 הוא האינטנסיביות של אזור נלקח מחוץ לתא (רקע) בזמן 0 (קרי, הפריים הראשון לאחר photoactivation). באופן אופציונלי, להמחשת טוב יותר של הנתונים, לנרמל את העקומות בעוצמה 0 על-ידי חיסור האינטנסיביות של המסגרת הראשונה לאחר photoactivation מכל מסגרת עוקבות.הערה: שיטת הניתוח הבא (שלבים 9.6-9.8) גם מאפשר חישוב פיזור cytosolic של אקטין photoactivated בתוך ציטוזול. למדוד עוצמות עבור אזורים cytosolic, אשר ממוקמות ברצף רחוק מאזור הפעלה. כדי לייצג את עוצמות של אזורים אלה אחוז בעוצמה של האזור photoactivated בזמן 0, החל 8 משוואת, איפה lamellipodial עוצמות מוחלפים עם עוצמות עבור כל רועי cytosolic. הגודל והמספר של האזורים עשוי להשתנות בהתאם המרחק גודל ופיזור התא שברצונך למדוד. להפיק ערך לכימות עבור שיעור של חלבון photoactivated שחדר בכל אזור cytosolic, להדביק את הזמן ואת הערכים של העקומה עליית עוצמת קרינה פלואורסצנטית לכל אזור סיגמא התוויה (בדומה הניתוח FRAP בסעיף 7), להשתמש משוואה 2 ו- 4 משוואת להפיק המחצית של עוצמת קרינה פלואורסצנטית להגיע מישור. השווה את הערכים1/2 t בין קבוצות שונות ניסיוני.

Representative Results

איור 1 g h עולה שלב תמונות חדות של תאי פיברובלסט NIH3T3 מוקדמת, microinjection אחרי 10 דקות של Rac1, אשר הוא GTPase רו משפחתי קטן מסוגל גרימת היווצרות lamellipodia דרך ביחסיו עם הגל מורכבים. התא הוא מדמיין קודם לפני microinjection (איור 1g), כדי לאשר את הכדאיות שלה, מורפולוגיה, למשל חוסר lamellipodia. ב microinjection אחרי 10 דקות, התא השתנה בבירור מורפולוגיה שלה, אשר צפוי מטיפול זה, ומציין זריקה מוצלחת (איור 1h). על פשטות ובהירות, הבא אנו מספקים תוצאות למופת לניתוח FRAP ו photoactivation ב תאים, אשר יש לא היה בנוסף microinjected. ניתוח של המחזור של מתויג EGFP VASP בקצה lamellipodium מוצג באיור 2-f. שימו לב כי VASP בנוסף מטרות המתהווה, מוקד הדבקויות, נקודות קטן ומוארך מתא פנים18,19. עוצמת קרינה פלואורסצנטית של אזור lamellipodial עם הצטברות VASP ברור בקצה מולבן, נמדדת לכל מסגרת זמן, בעקבות קו המתאר של רועי לפני, במהלך, ואחרי הלבנת כפי lamellipodium בולט לפנים. כמו חלבונים EGFP-VASP מולבן להיות ממוחזרים על ידי מולקולות שאינן קשה באתרים אלה, התאוששות הדרגתית של קרינה פלואורסצנטית הוא ציין (איור 2b). העקומה שחזור FRAP שהושג בצורה הזאת, מנורמל עוצמת אקונומיקה מראש (המבוטא 1) ניתן לראות באיור 2c. יעילות Photobleaching יכול להשתנות, היה כ- 20% של הערך לפני הלבנת בדוגמה זו, כפי שנקבע מן הערך t0 (המסגרת הראשונה לאחר photobleaching). העלייה של קרינה פלואורסצנטית מגיע מישור בדוגמה המוצגת ב בערך 80% זריחה לפני הלבנה. מבנה סטטי במהלך זמן הניסוי, כגון אדהזיה מוקד, ההבדל בין עוצמת אקונומיקה מראש על ידי קרינה פלואורסצנטית מישור הגיעה לאחר השחזור מוגדרת השבר משותק (אם, החץ האדום באיור 2 c, e), ואילו כמות קרינה פלואורסצנטית החלים בין הזמן של הלבנת ושחזור מלא מוגדרת בתור השבר ניידים (ירוק לחץ דו-ראשי, איור 2c, e). שימו לב כי במבנה בשומר כגון הטיפ lamellipodium ניתח כאן, היקף IF עשוי לייצג מולקולות משותק אלא נובעות גם ירידה של בליטה מהירות, כידוע עוצמת EGFP-VASP לסמוך על זה פרמטר18. כדי לחשב את החצי-זמן ההחלמה, עיקול בכושר נוצר על סיגמא התוויה (איור 2d). במקרה זה, הערך של הפרמטר “b” מופק בפתרון משוואה 2 שווה ל 0.0754, אשר חלה על הפונקציה לוגריתמי (משוואה 4) תוצאות חצי-בזמן משוער של התאוששות של 9.19 s (איור 2-d , לוח הימין), שזה יחסית מהיר בתא מסוים זה לעומת הממוצע שפורסם בעבר5. יש לציין כי חצי-זמני התאוששות עשויה לפעמים להשתנות באופן משמעותי מתא לתא בתוך מאותה אוכלוסייה. לכן, להשגת תוצאות נציג, אנו ממליצים בקביעת פרמטר זה כמו ממוצע מתאי לפחות 15-20. כדי להמחיש את מידת השונות, אריתמטיקה אמצעי השחזור EGFP-VASP בממוצע 15 תאים עבור כל נקודת זמן היו שנוצר (איור 2e), עקומת ממוצע מתאים שנוצרו ומוצג בצורה מקבילה (איור 2 f). שיעור פלמור אקטין lamellipodial הרשת כוללת הסכום של חדירת רשת קדימה וזרימה רטרוגרדית. ניתן להחיל FRAP למדידת קצב פלמור אקטין על ידי תאים transfecting (במקרה זה B16-F1) ועם מתויג EGFP β-אקטין photobleaching אזור lamellipodial בולטות (איור 2g). לניתוח של lamellipodial אקטין רשת פלמור, התאוששות זריחה על הלבנה של מתויג EGFP β-אקטין שקובעת לאורך זמן. כמו פלמור של התקדמות מונומרים של אקטין בקצות טקסוס חוטים אקטין lamellipodial (אשר כל הצבע לקראת קבלה20), הרשת היא rearwards translocated כל הזמן והוא מתקדם בעל-פה, המחירים אשר יכול להיות בקלות לקבל באמצעות שחזור מקוטב של זריחה על photobleaching. קרינה פלואורסצנטית שחזור של lamellipodium השלמת ברגע לאזור מולבן הגיעה לאזור המעבר בין החלק האחורי של lamellipodium lamella, אשר מאופיין על ידי צפיפות נמוכה של צרורות מסודרים אופקית נימה יותר בעיטה הרבה יותר לאט מאשר מה הוא ציין את lamellipodium. כמופיע ב איור 2g, קרינה פלואורסצנטית השחזור ניתן לאבחן כקו אופקי הקצה, זורם אחורנית לכיוון lamella, המאפשר מדידת המרחקים של בליטה וזרימה רטרוגרדי (מיוצג באופן אינדיבידואלי שבלוח הימני של איור 2g כחצים כתום ואדום דו-ראשי, בהתאמה). לנו יש להחיל גם photoactivation בתאים B16-F1 transfected עם הרשות הפלסטינית-GFP-אקטין כדי לעקוב אחר הניידות של מונומרים של אקטין בתוך ציטוזול הקצב של שלהם לצאר בולטות lamellipodia. כמופיע באיור 3א, ב, אזור cytosolic היה photoactivated על ידי חשיפה 405 ננומטר לייזר, בעוד תמונות נרכשו ב- GFP ערוץ כל 1.5 s המדגימה את ההפצה של אקטין photoactivated מסומנות GFP. ניתן לראות Photoactivated GFP-אקטין לשדר מהאזור cytosolic איור 3ב’. הקצב של הקטנת עוצמת קרינה פלואורסצנטית באזור cytosolic photoactivated מיוצג כאחוז של עוצמת הראשונית-t0 (תחילה מסגרת לאחר photoactivation; איור 3 ג). Photoactivated אקטין גם משתלב בקצות lamellipodia, איפה חדש מונומרים של אקטין מתווספים בקצוות טקסוס הגוברת של מתארך אקטין חוטים במהלך ההחלמה. כדי להעריך את קצב התאגדות lamellipodial, מדדנו את עוצמת קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן של קו מתאר/אזור דו-ממדי של 5 µm רוחב ו 1 מיקרומטר בגובה; האזור היה כל הזמן מחדש ממוקם בקצה lamellipodium כפי וצווארי. אקטין התיעוש היה מיוצג האחוז של קרינה פלואורסצנטית בעוצמה של האזור cytosolic photoactivated-t0 (איור 3ד’). כפי התארכות של אקטין חוטים התקדמה חדש מונומרים של אקטין שולבו בחזית lamellipodial. שבריר של אלה מונומרים של אקטין stochastically נגזר מן הבריכה cytosolic איפה מונומרים היו photoactivated. התוצאה היא העלייה המהירה של זריחה ב- lamellipodia ב- 20 הראשון s לאחר photoactivation. כמו מונומרים חדשות מתווספות לפנים lamellipodial, זרימה מונומרים אקטין בעבר incorporated זיריהם לכיוון lamella על ידי זרימת רטרוגרדית. לאורך זמן, רועי מתמלא לחלוטין מונומרים פלורסנט, מישור ב פלורסצנטיות נגיש (איור 3ד’). ירידה הדרגתית פלורסצנטיות ואז נוצרת כאשר, בעקבות דיפוזיית photoactivated מונומרים ברחבי התא, מונומרים של אקטין הלא-photoactivated יותר ויותר מחדש מתווספות לחזית lamellipodial. זו ירידה בקרינה פלואורסצנטית תוכלו למצוא מישור חדש, אשר ניתן להגיע ברגע איזון התא כולו בין מונומרים photoactivated ו- photoactivated שאינו נגיש (נתונים לא מוצג). הניידות של מונומרים של אקטין ברחבי ציטוזול נגזר על ידי מדידת עוצמות קרינה פלואורסצנטית אזורים בגודל זהה ממוקם רחוק מאזור photoactivated (דוגמה על איור 3 לפי אזורים צבע מקודד עם תוויות R1-R5). כמופיע ב איור 3e, עוצמת קרינה פלואורסצנטית בכל אחד מאזורים אלה ופוחת ממנו cytosolically באזור photoactivated, כמו השבר של מונומרים של אקטין photoactivated הופך להיות יותר ויותר מדולל עם שלא הופעל מונומרים (קרי, ללא-פלורסנט). יתר על כן, הפסגה של קרינה פלואורסצנטית הגיע מאוחר יותר: ככול שרחוקים יותר נמדד האזור נמצא מאזור photoactivated, ככל הזמן הנדרשת עבור מונומרים של אקטין להתפשט לאזורים אלה. ערך נציג לתואר של אקטין מונומר חדירה לתוך כל אזור ניתן לגזור על ידי לכימות חצי שעת להגיע רמת קרינה פלואורסצנטית. ככול שרחוקים יותר באזור, ככל שלוקח את אקטין photoactivated לנטרל את זה, ובכך יותר זמן נדרש עבור הרמה פלורסנט להגיע, בסופו של דבר שמוביל ערך1/2 t גבוה יותר (איור 3e). איור 1 : הדמיה קאמרית בהליך ההרכבה, microinjection. רכיבי קאמרית () הדמיה. (b) סיליקון גריז מרוח בזהירות סביב הפתח של סילר לאיטום פלסטיק. (ג) coverslip ממוקם עם הצד-התא פונה כלפי מעלה אל מרכז החדר הדמיה פתיחה. (ד) מאובטחת חותם נוסדה על ידי מיצוב חותם פלסטיק מעל coverslip על ידי הידוק את התפסים בצד. (e) מיקרוסקופיה בינוני הוא pipetted לתוך החריץ קאמרית. (f) לחדר ההדמיה ממוקם על הבמה מיקרוסקופ, גלאי חום ואלקטרודות מקושרות אל יחידת חימום טרום מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס, תאים מותר להסתגל במשך לפחות 30 דקות לפני מיקרוסקופ מאותחלת. בדוגמה זו, הבמה מיקרוסקופ הוא מצויד גם עם micromanipulator לביצוע microinjections, המחט microinjection מוכנס לתוך האמצעי המכסים את שכבת תאים במחסנית הדמיה. תאי פיברובלסט (g) NIH3T3 הוא מדמיין לפני microinjection על ידי מיקרוסקופ שלב-ניגודיות. הצלב האדום בתוך התא perinuclear מציין את מיקומו של microinjection בעתיד, התואם לאזור cytoplasmic גבוהה מהקרבה קרוב לגרעין מגושם. (h) 10 דקות אחרי microinjection עם Rac1, התא מגיב על ידי היווצרות הבולטים של lamellipodia ברחבי הפריפריה התא כולו (המסומנים על ידי חצים ירוקים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2: FRAP מאפשר קביעת המחירים של חלבון פלמור אקטין מחזור או lamellipodial. () נציג דוגמה תא B16-F1 לבטא EGFP-VASP לפני photobleaching של אזור lamellipodial כמצוין. קווי המתאר בצבעים שונים/צורות מסומנות כדי לציין באילו אזורים נחשבו למדידות עוצמת קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן. הערה קווי המתאר אדום מסומן עם סימן קריאה, אשר מתייג אזור cytosolic ממוקם באזור המכיל מרובים שלפוחית, קפלים פני שטח התא. אזורים דינמי כזה יש להימנע לבחירת מחוזות הפניה פלורסצנטיות, כפי הם מאופיינים חזק לטווח קצר תנודות של זריחה, ובכך לגרום תוצאות לא מדויקות. (b) Lamellipodial אזור של EGFP-VASP התא לביטוי לפני ואחרי photobleaching. ההתאוששות של ניאון האות לאחר photobleaching בתוך האזור. בצבע סגול הוא מדמיין לאורך זמן. החץ מצביע על קצה microspike, מועשרים לתעשיית VASP ככל הנראה עקב צפיפות גבוהה של אקטין חוטים שם polymerizing19. (ג) דוגמה FRAP שחזור עקומה כמו נגזר לכימות עוצמת lamellipodium photobleached (מתאר סגול) ב’ אדום פלואורסצנטי ולציין הקו הירוק מימין, בהתאמה, שברים משותק, ניידים. (ד) A מתאים של העקומה שחזור FRAP ג’ (החלונית הימנית), דוגמה לשיטת חישוב להפיק את זמן ההחלמה חצי (לוח נכון). (e) דוגמה של החלמה FRAP עיקול נגזר בממוצע את עקומות שחזור זריחה של תאים 15, עם ברים SEM המציינת את מידת ההשתנות בתוך האוכלוסייה המדגם. התאמה (f) עיקול נגזר בממוצע את השחזור FRAP עקומת מתאים של תאים 15 (החלונית הימנית), דוגמה לשיטת חישוב להפיק את זמן ההחלמה חצי (לוח נכון). (g) לוחות בצילום מואץ של בולטות lamellipodium של תא B16-F1 ביטוי מתויג EGFP β-אקטין לפני ואחרי ניקוי הפנים של אזור lamellipodial כמצוין, ואחריו השחזור של זריחה lamellipodium לאורך זמן. בלוח הימני, הערכים שנמדדו עבור חדירת ומסופקים מרחקים רטרוגרדי (כתום ואדום, בהתאמה). חישובים תחת הלוחות התמונה חושפים כיצד הסכום של בליטה ומרחקים רטרוגרדית משמשים להפיק קצב פלמור של הרשת אקטין lamellipodial. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3: Photoactivation של הרשות הפלסטינית-GFP-אקטין עבור מונומר מעקב ברחבי התא. () א נציג דוגמה תא B16-F1 לבטא הרשות הפלסטינית-GFP-אקטין לפני מפעילה photoactivation באזור cytosolic, כפי שמציין את עיגול אדום (PA). קווי המתאר בצבעים שונים מסומנות כדי לציין באילו אזורים נחשבו למדידות עוצמת קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן. photoactivation (b) איור של ההתפלגות הטמפורלי של הרשות הפלסטינית-GFP-אקטין הבאים. הערה ההפחתה ההדרגתית של זריחה ב- photoactivated, אזור cytosolic (עיגול אדום), כמו אקטין photoactivated מפזרת ממנו. בשל דיפוזיה שלהם בחזית, הרכבה לרשת, מונומרים של אקטין photoactivated בהדרגה משופרים lamellipodia (אזור ציאן) וברחבי את ציטוזול (אזורים בצבעים שונים) מרחק ותלוי זמן אופנה. (ג) נציג, זמני שקיעת פלורסצנטיות בתוך אזור cytosolic photoactivated (אדום מתאר ב’). (ד) הטמפורלית שינויים בעוצמת זריחה באזור lamellipodial (ציאן מתאר ב’). (e) נציג של השינויים זמני זריחה בעוצמה של אזורים cytosolic (מקודדים ב- b) עקב מיקום במרחקים משתנה מאזור photoactivation ‘ עקומות ‘. שימו לב איך חצי-פעמים להגיע על ידי קרינה פלואורסצנטית מישור (שמצוין באגדה מצד הימין) הגדל עם המרחק של נתון האזור לאזור של photoactivation, סביר להניח לקשר עם מוגברת פעמים הדרושה ביזור של מונומרים של אקטין לתוך אזור בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

כאן נדון קריטי בשלבים הטכניקות המתוארות במאמר זה, איך הם ניתן למטב ליישום בתנאי ניסוי שונים.

Microinjection היא שיטה שניתן להחיל כדי לעקוב אחר תאים את ההשפעות המיידיות של היכרות עם חלבונים אקסוגני, מעכבי או סמים. זה יכול להיות יתרון מיוחד עבור קביעת הפונקציות של חלבונים במקרים קשים כדי transfect סוגי תאים או במצבים בהם ביטוי ארוכות טווח אינו רצוי. יש לציין כי ההישרדות של סוגי תאים מסוימים משתנה בהתאם הם נמצאים נזרע על מטריצות. ביותר אנדותל, אפיתל או דמוי פיברובלסט סוגי תאים, אפילו קטנים כמו דגים keratocytes (ראה דאנג. et al. 21 , אנדרסון ו- Cross22) יכול להיות בהצלחה מוזרק. עם זאת, ישנם מצבים חריגים, כגון תאים B16-F1 נזרע על laminin, אשר מהווה מערכת דגם מעולה של נדידת תאים, אך אינם תואמים להזרקת על סוג זה של תשתית מסיבה לא ידועה. עבור תאי פיברובלסט NIH3T3, אנחנו באופן שגרתי לבצע זריקות fibronectin תשתית וטכניקות photomanipulation נוספים כגון FRAP (אפילו עם photoactivation; המוצגות עבור תאים B16-F1 כאן) יכול להתבצע באותה מידה באלה fibroblasts (ראה למשל, . Köstler et al. 3). זה חייב להיות גם נחשב כי חלבונים שונים, על פי מאפייניהם פונקציונלי, היעדים ניסוי, עלול לקחת כמויות שונות של זמן כדי לגרום לשינויים, משתנה משניות עד שעות. יתרון של הטכניקה היא כי המינון/הריכוז של הסוכן אקסוגני ניתן לשלוט בצורה מדויקת יותר באותה רמת תא בודד מאשר, למשלבעת שימוש פלסמיד תקנים. בנוסף, תיוג פלורסנט של חלבון היא לא הכרח כדי להבטיח את הנוכחות שלו בתא, אשר יכול להגביר את הגמישות אם מרובה ערוצים בו זמנית, החזיית לחלבונים אחרים מתויג fluorescently נדרשת. Microinjection יכול להיות שימושי במיוחד עבור ניתוח השפעות מיידיות של חלבונים ספציפיים או תערובות חלבון על שינויים דינמיים של מורפולוגיה תאים או את שלד התא (למשל, דאנג. et al. 21 לקבלת דוגמה של השפעות מיידיות על הגירה ידי המדכא מורכבים Arp2/3 Arpin). חיסרון של הטכניקה היא invasiveness שלה, אשר יכול לגרום נזק או להשפיע על מורפולוגיה תאים. לכן, שיקול חשוב בעת ביצוע microinjections מנטר את הכדאיות התא. השיטה הציג כאן מסתמך על מניפולציה ידנית. בתנאי שעברו בדיקת תאימות עם זריקות מוצלחות, כגון fibroblasts גוברת על תשתית fibronectin, פרוטוקול הזרקה ידנית המתוארים כאן מאפשר שיעור 100% הצלחה ליד; זה חיוני כאשר שילוב של גישה זו עם ניסויים מעקב מתוחכם ולגזול כולל מיקרוסקופ וידאו או FRAP, כפי שפורסם בעבר3. זו אינה שוללת את זה מדי פעם, תאים בודדים אולי סובלים אירוע microinjection, אשר ניתן לזהות בבטחה על ידי שינויים פתאומיים של ניגוד של גרעין והן ציטופלזמה, ואחריו תא קצה התנצלות. במקרים נדירים כאלה ניסיוני נשלל, ולכן לא נחשבת עבור ניתוחים נוספים.

עם זאת, הגישה של חצי-אוטומטיים הוא גם נפוץ, למשל העסקת מהירה (< 300 ms) שבשליטת מכונת המחט הנמכת חופפת עלייה בלחץ ההזרקה, כך המחט יש רק למקם מעל כל תא לפני בהתאמה זריקה. שיעור ההצלחה של חצי-אוטומטיים זריקות הוא בהגדרה נמוכה יותר מאשר הגישה הידנית שתוארה לעיל, פשוט כי זה ממוטב עבור מהירות, ואחריו ניתוח של מספר תאים ששרד בהצלחה את הטיפול הזה; לכן זה אין לסמוך על הזרקת מוצלחת של תא יחיד. לכן, בניגוד לתא בודד ניתוח, זריקות חצי-אוטומטיים מתאימים יותר עבור ניתוח השפעות הזרקת תאים כמה מאות, למשל, על ידי מיקרוסקופ וידאו בהגדלה נמוכה או על קיבוע תא, צביעת. ללא קשר הגישה מפורט המועסקים, microinjection אינו מהווה וזמינותו של מובילים, אבל יכול להיות משולב עם מגוון רחב של טכניקות, כולל FRAP או photoactivation3.

לצורך קביעת שיעור תחלופה חלבונים על ידי FRAP, עוצמת הלייזר חייבים להיות אופטימיזציה, בהתאם לתנאי תוכנית ההתקנה והדמיה מיקרוסקופ (הגדלה, מטרות, וכדומה, כמו גם סוג התא, מבנה, חלבון פלואורסצנטי עבור photobleaching). שימו לב כי על עוצמת הלייזר אופטימלית, הלבנת יעיל בשילוב עם נזקי בהקדם האפשרי, כדי למנוע התכווצות או להשלים הכחשה של המבנה תחת ניתוח (למשל, lamellipodia או filopodia) או אפילו נזק ברמה התאית. באופן אידיאלי, לפחות 70 – 80% של הלבנת יעילות צריך להיות מושגת, למרות הלבנת שלם עשוי להיות הכבידו על ידי תחלופה מהירה מאוד של החלבון, שבו במקרה, משהו מעל 50% עשוי גם להיות מקובל. חשמל הלבנת אופטימלית עבור מבנה נתון ו הפלורסנט צריך להיבדק ניסיוניים, החל מכוח לייזר נמוך ולאחריו עלייה הדרגתית שלה. כמובן, כל הפלורסנט יכול לפי ההגדרה להיות מולבן עם לייזר אור קרוב לשיא של עירור (488 ננומטר עבור צבעי ירוק נפוצות כגון FITC או EGFP). עם זאת, לייזרים עם אורכי גל קצרים יותר, כגון לייזרים בקרבת מקום ל- UV, לספק הכוחות הגדולים, ובכך ניתן להשתמש גם עבור הלבנת יעיל של צבעים נפוצים. אנו מעסיקים באופן שגרתי 405 ננומטר דיודת לייזר (120 mW) עבור ניקוי הפנים של EGFP וגם אדום צבעי פלורסנט (כגון mCherry), אמנם עם מעט נמוך יותר יעילות במקרה של הלה (הנתונים לא מוצג). כמו 405 ננומטר-דיודה יכול לשמש גם עבור photoactivation של הרשות הפלסטינית-GFP (ראו להלן), זה מעניק מערכת זו עם גמישות מירבית.

כדי להפוך את מבנה התא B16-F1 חלבונים פלורסנט photobleached כאן, הוחלו 405 ננומטר לייזר כוחות בין 65-100 מגוואט. בעת ניתוח של אזור photobleached, חשוב לשקול אם המבנה נתון נשמר בצורתו המקורית לאורך הניתוח תקופת זמן. למשל, בעת ניתוח מחזור של חלבונים-lamellipodia טיפים, כדאי לשים לב אם העקמומיות של lamellipodia היא שונה באופן משמעותי לאורך זמן, כמו שינויים עקמומיות עלול להוביל תוצאות לא מדויקות, אם ניתח את האזור/קווי המתאר אינה מלא מקיפים את מכלול המבנה בכל מסגרת נמדד. בנוסף, יצוין כי חבילות מוטבע lamellipodia, כגון microspikes, עלול לגרום סטיות בעוצמתם זריחה. כמופיע באיור 2b (חץ לבן מסגרת זמן s 9), מבנה דמוי microspike ממוקם בסמוך לאזור photobleached נמדד, אבל נשאר מחוץ לזה לאורך כל משך מדידה, ולכן אינו גורם שום דיוקים. עבור ניתוח תחלופת חלבון, הם שיקולים חשובים בעת בחירת המיקום והגודל של מנותח אזורים כי שלהם פלורסצנטיות לאורך זמן צריך באופן משמעותי אל תושפע שינויים מורפולוגיה תאים או גורמים אחרים מאשר קשה להימנע רכישת photobleaching. למשל, מבנים מתן תרומה משמעותית כמותיים למבנה שנותחה לא תשתנה מהאזור שנמדד במהלך ניתוח; בנוסף, גופים שאינם קשורים, פלורסנט כגון מבנים vesicular למשוך את החלבון יפלח לא בתחום של הריבית במהלך ניתוח. לקביעת שיעור פלמור אקטין lamellipodial, כדאי לשים לב כי אין מפסק או שמנפח (קרי, מתקפלים כלפי מעלה) lamellipodia מנותחים, כמו זה מאוד משפיעים על הדיוק של התוצאות. בנוסף, הכחשה של אזורים lamellipodial עשויים להופיע רוברטסונית ובמתקן מהירה, שעלול כדי מופרזת של שערי פלמור אקטין lamellipodial. שיקול נוסף הוא המרחק של אזורים נורמליזציה תאיים (נלקח בתור הפניה מיקומים עבור התיקון של רכישת photobleaching) מן המיקום בפועל של photobleaching, אשר צריך להיות גדול מספיק כדי להימנע ישירה להשפיע על-ידי האזור photobleached.

בעת הגדרת תנאים אופטימליים photoactivation של הרשות הפלסטינית-GFP-מתויגים ‘ בונה, להקפיד להימנע הלבנת מיידית במהלך photoactivation. העבודה שלנו, התקבלו התוצאות הטובות ביותר עם כוחות לייזר 5 – 10 פעמים נמוך יותר מועסקים בדרך כלל עבור הלבנה של EGFP. עבור רכישת התמונה של מולקולות photoactivated, זמן החשיפה, מרווח הזמן בין מסגרות צריך להיות אופטימיזציה על ידי בהתחשב בגודל של אזורים ומבנים להיות photoactivated וניתח, כמו גם הניידות פוטנציאל של photoactivated חלבונים למיקומים אחרים subcellular. לגבי כל סוגי קרינה פלואורסצנטית הדמיה, תחזוקה של הכדאיות התא חיוני להשגת תוצאות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית.

בעקרון, ירוק-עד-אדום photoconversion של חלבונים פלורסנט כגון mEos או Dronpa גרסאות12 מהווה שיטת בעל עוצמה באותה מידה של דינמיקה הבאים מחזור של מבנים subcellular כמו lamellipodium (ראה למשל, ווה. et al. 23)-היתרון של השיטה השנייה בניגוד הרשות הפלסטינית-GFP יהיה האפשרות לעקוב dynamics חלבון לפני ואחרי הגיור עם שני צבעים ברורים, ללא צורך להביע משותפת של חלבון פלואורסצנטי אדום נוספים. עם זאת, בניסויים שלנו ראשוני, מידת שינוי החדות והעוצמה של אותות פלואורסצנט מושגת על photoactivation של הרשות הפלסטינית-GFP היה גדול יותר לעומת photoconverted הגששים, אולי בשל התכונות ספקטרלי מעולה של הירוקים מול אדום הגששים פלורסנט (נתונים לא מוצג). בכל מקרה, מחקרים מפורטת על אקטין מחזור הלהט ב בליטות תא-קצה כגון lamellipodia או זנבות אקטין הנוצרות על-ידי וירוס Vaccinia עד כה רק פורסמו באמצעות הרשות הפלסטינית-GFP נגזרים5,6,24.

כאשר בוחנים איזה. אזור תא לנתח בעקבות photoactivation, מספר גורמים צריכים להילקח בחשבון, אשר נידונות לפי הדוגמה ספציפי המוצג כאן (התאגדות של מונומרים של אקטין בקצה תא בעת הפעלת ב ציטוזול), אבל יכול בהחלט להיות אומדן מקבילה לבעיות מדעיות שונות. ראשית, כאשר מדידת שיעור התאגדות lamellipodial cytosolically photoactivated חלבונים, למשל, בתנאי הניסוי ברורים (כפי שמוצג Dimchev. ואח 6), גדלים של אזורים cytosolic ומרחקים שלהם לקצוות lamellipodial אמורים להיות דומים במהירותם בין קבוצות הניסוי. זה גם חשוב לשקול זאת כאשר באזורים cytosolic photoactivating, העובי תא גדול בתנוחות קרוב יותר את הגרעין. הפעלת אזורים הסלולר עבה עשויה לגרום כמויות גבוהות יותר של חלבונים מופעל, בהתחשב בכך ההתפלגות של החלבון תופעל מופץ למשל ציטוזול. לבסוף, רמות הביטוי של החלבון להיות מופעל יכול בהחלט להיות משתנה מאוד בתאים בודדים. בשל כל אלה שיקולים של השתנות, חשוב להשוות בין רמות התיעוש של חלבונים cytosolically שהופעל במקום אחר בתא יחסית קרינה פלואורסצנטית הכולל שהושג על הפעלת באזורים ספציפיים.

תארנו כיצד microinjection יכול לשמש ככלי עבור חוקרים את ההשפעות של חלבונים על מורפולוגיה תאים, יש כשניסחתי זה הממחיש את אינדוקציה חזק של מבנים lamellipodial NIH3T3 פיברובלסטים microinjected עם GTPase Rac1 קטן. אנחנו החלת בעבר טכניקה זו להתערב עם פונקציית Arp2/3 תאים microinjected עם המחשבים WCA C-מסוף של צלקת/גל3. ניתן לנתח אותם פרמטרים שונים בתאים microinjected על ידי מבחני אחרים, כגון FRAP או photoactivation. תארנו כיצד FRAP, photoactivation יכול להיות מועסק עבור חוקרים את הדינמיקה subcellular וניידות של מונומרים של אקטין. FRAP כבר בשימוש על ידי הקבוצה שלנו בעבר5 כדי לחקור את המחזור של חלבונים ההתאמה לשפות אחרות כדי lamellipodia, כגון VASP, אסתי, cortactin, cofilin, וכיסוי חלבון, או עבור שחקרתי המחזור של הרכיבים השונים הדבקויות מוקד בנוכחותו היעדר Rac איתות4. יתר על כן, מדידת המחירים פלמור אקטין יכול להתבצע על ידי photobleaching β-אקטין מתויג EGFP5, אך קיימות שיטות אלטרנטיביות. מעקב inhomogeneities פלורסנט כפי שנראה תא חי הדמיה תואמי הגששים תיוג חוטים אקטין הסלולר, כגון Lifeact25, יכול גם להיות מועסקים6,26. היתרון כאן הוא כי ביטוי של β-אקטין ניתן להימנע, אשר מסוגל הגדלת תא קצה בליטה והעברה, ובכך פוטנציאל משבשת assay ספציפי או שאלה ניסיוני (ראה למשל Kage. et al. 26; Peckham. et al. 27). עם זאת, בעמדת נחיתות של המכשיר Lifeact מהווה שלה מהירה on/off קינטיקה של כריכת חוטים אקטין, כך הלבנת המבנים פילמנט אקטין המתויגים באמצעות Lifeact בתאים מספק מידע רק על תחלופת בדיקה, אבל לא המחזור של חוטים אקטין, שאליו הוא נקשר25. המעקב של זריחה inhomogeneities עבדה בעבר6,26 לספק פשרה מעשית, דומה הרבה המעקב בשימוש נרחב של קרינה פלואורסצנטית ספאקלס שולבו filamentous cytoskeletal מבנים (ראה למשל, סלמון, ווטרמן28), אבל לא יכול להיות כמו ישר קדימה כדי להשתמש, בדיוק. כפי FRAP מבני מתויג EGFP F-אקטין. Photoactivation הוחל על ידינו עבור הערכת שיעור של אקטין monomeric שהשתלבה בולטות lamellipodia, כמו גם את הניידות שלה ברחבי ציטוזול, בהקשר של השפעול מכוון cytosolic F-אקטין רמות6. הטכניקה זו שימושית כאשר בחינת ניידות והפצה של חלבונים שמקורם אזורים גדולים יחסית, כגון אזורים cytosolic. עם זאת, בחינת ההתפלגות של חלבונים שמקורם מבנים photoactivated קטן יחסית; למשל, צמיחה קונוסים עשויה להיות מאתגרת המספרים הנמוכים של מולקולות פלורסנט מופעל, אותות חלשים וכתוצאה וכך חוסר רגישות. טכניקות חלופיות אפשריות photoactivation או photoconversion של קרינה פלואורסצנטית (ראה לעיל) עשויים לכלול ההופכי FRAP, הנשענת על photobleaching את התא כולו למעט רועי, ולאחריו מעקב הניידות של מולקולות פלורסנט להתרחק ממנו אזור זה. הטכניקה אינה דורשת overexpressing photoactivatable גירסאות של חלבונים, אך תמיד יכלול מנה גבוה באופן חריג של עוצמת הלייזר, ובכך לגרום תופעות לוואי לא רצויות כגון נזקי חשיפה.

Photoactivation ו- FRAP אי אפשר להבחין בבירור חלבונים עוברים מונומרים, הדימרים או oligomers קטן אפילו והאם הם זזים בשילוב עם שותפים נוספים מחייב. מידע מסוג זה ניתן להשיג במקום פלורסצנטיות המתאם ספקטרוסקופיה טכניקות29 או, לחילופין, FLIM-סריג30. למרות זאת, FRAP, photoactivation מהווים פשוטה גישות להעריך ישירות dynamics גלובליים ומקומיים החלבון בתאים, ללא התחשבות החלבון של ריבית, subcellular מיקום או סוג התא למד.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנחנו מודים ל קרן מחקר גרמני (DFG) תמיכה כספית (גרנט Nr. RO2414/5-1 ל- KR).

Materials

B16-F1 mouse skin melanoma cells  American Type Culture Collection, Manassas, VA CRL-6323
NIH-3T3 cells American Type Culture Collection, Manassas, VA CRL-1658
DMEM 4.5g/L glucose  Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany 41965-039
Ham’s F-12 medium Sigma-Aldrich N8641
Fetal calf serum  (FCS) PAA Laboratories, Linz, Austria A15-102
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich, Germany F7524 Lot054M3396
MEM Non essential amino acids  Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany 11140035
L-Glumatine 200mM (100x) Life Technolgies 25030-024
Pen-Strep 5000 U/mL Life technologies 15070063
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany 11360-039
Laminin Sigma-Aldrich L-2020
Laminin coating buffer  Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl
Fibronectin from human plasma  Roche Diagnostics, Mannheim, Germany 11 051 407 001
Jetpei Polyplus Transfection, Illkirch, France 101-10N
JetPei buffer Polyplus Transfection, Illkirch, France 702-50 150mM NaCl
PA-GFP-actin plasmid DNA  described in Koestler et al.2008
pEGFP-actin plasmid DNA Clontech, Mountain View, CA, USA
Rac1 protein for microinjection Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection
Microinjection buffer Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany D1864
Microscope circular cover glasses 15mm, No.1  Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany 1001/15
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf, Hamburg, Germany 5242 956 003
Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips Eppendorf, Hamburg, Germany 930000035
Silicone Grease  ACC Silicones, Bridgewater, England SGM494
Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber Warner instruments RC-26
Automatic temperature controller Warner Instruments TC-324B
Microscope: Axio Observer  Carl Zeiss, Jena, Germany
CoolSnap-HQ2 camera  Photometrics, Tucson, AZ
Lambda DG4 light source  Sutter Instrucment, Novato, CA
Laser source  Visitron Systems
Eppendorf FemtoJet microinjector  Eppendorf, Hamburg, Germany With built-in compressor for pressure supply
Nikon Narishige Micromanipulator system Nikon Instruments, Japan
Visiview software v2.1.4 Visitron Systems, Puchheim, Germany
Metamorph software v7.8.10 Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Sigma Plot v.12 Systat Software Inc.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  2. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques–FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  3. Koestler, S. A., et al. Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin. Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).
  4. Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. J Cell Sci. 126, 4572-4588 (2013).
  5. Lai, F. P., et al. Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia. EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).
  6. Dimchev, G., et al. Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly. Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).
  7. Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility. Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).
  8. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  9. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  10. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
  11. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).
  12. Kremers, G. J., Piston, D. Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells. J Vis Exp. (40), (2010).
  13. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of slides and coverslips for microscopy. CSH Protoc. 2008, 4988 (2008).
  14. Small, J. V., Rottner, K., Carlier, M. F. . Actin-based Motility. , (2010).
  15. Kaverina, I., et al. Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules. Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).
  16. Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. Visualising the actin cytoskeleton. Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).
  17. Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. Centripetal transport of microtubules in motile cells. Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).
  18. Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. VASP dynamics during lamellipodia protrusion. Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).
  19. Svitkina, T. M., et al. Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network. J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).
  20. Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. Polarity of actin at the leading edge of cultured cells. Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).
  21. Dang, I., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).
  22. Anderson, K. I., Cross, R. Contact dynamics during keratocyte motility. Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).
  23. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).
  24. Humphries, A. C., et al. Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread. Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).
  25. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  26. Kage, F., et al. FMNL formins boost lamellipodial force generation. Nat Commun. 8, 14832 (2017).
  27. Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin. J Cell Sci. 114, 1367-1377 (2001).
  28. Salmon, E. D., Waterman, C. M. How we discovered fluorescent speckle microscopy. Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).
  29. Machan, R., Wohland, T. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems. FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).
  30. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging–techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).

Tags

MicromanipulationCytoskeletal RegulatorsFRAPPhotoactivationB16-F1 CellsNIH 3T3 FibroblastsLamininFibronectinTransfectionMicroscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Dimchev, G., Rottner, K. Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators. J. Vis. Exp. (135), e57643, doi:10.3791/57643 (2018).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image