Électrochimique détection de cinétique effet isotopique sur extracellulaire Transport d’électrons dans Shewanella oneidensis MR-1
Summary
Nous présentons ici un protocole d’expériences électrochimiques cellule entière pour étudier la contribution du transport de protons au taux de transport des électrons extracellulaire par les cytochromes de la membrane externe complexes de Shewanella oneidensis MR-1.
Abstract
Direct de détection électrochimique de c-type incorporés dans la membrane externe bactérienne du cytochrome complexes (membrane externe c-type du cytochrome complexes ; OM c– Cyts) a récemment émergé comme nouvelle méthode analytique cellule entière pour caractériser le transport des électrons bactérien de la chaine respiratoire à l’extérieur de la cellule, dénommé le transport des électrons extracellulaire (EET). Alors que la voie et la cinétique de l’écoulement d’électron au cours de la réaction de EET ont été étudiés, une méthode électrochimique cellule entière pour examiner l’impact du transport de cations associé à EET n’a pas encore été établie. Dans la présente étude, un exemple d’une technique biochimique pour examiner l’effet isotopique deutérium (KIE) sur EET par OM c– Cyts utilisant un microbe modèle, Shewanella oneidensis MR-1, est décrite. L’EIC sur le processus EET peut être obtenue si l’EET par OM c– Cyts agit comme l’étape cinétiquement limitante dans la production actuelle microbienne. À cette fin, avant l’ajout de D2O, le surnageant a été remplacé avec les supports neufs contenant une quantité suffisante de donneur d’électrons pour soutenir le taux de réactions métaboliques en amont et de retirer les cellules planctoniques un uniforme monocouche biofilm sur l’électrode de travail. Méthodes alternatives pour confirmer la limitante étape dans la production actuelle microbienne comme EET par OM c– Cyts sont également décrites. Notre technique d’un dosage électrochimique cellule entière pour étudier la cinétique du transport proton peut être appliquée à d’autres souches microbiennes électroactif.
Introduction
Des techniques électrochimiques de qualifier directement une protéine d’oxydo-réduction dans une cellule bactérienne intacte ont récemment émergé depuis la découverte de souches microbiennes-réduction des métaux, tels que S. oneidensis MR-1 ou Geobacter sulfurreducens PCA, qui ont des complexes de cytochrome c-type de membrane externe (OM c-Cyts) exposés à la cellule extérieur1,2,3,4,5. L’ OM c– Cyts médiation transport des électrons de la chaine respiratoire à des substrats solides situé extracellulaire. Ce transport est dénommé extracellulaire transport d’électrons (EET)1,6 et est un processus critique pour les biotechnologies émergents, tels que les piles à combustible microbiennes6. Par conséquent, pour comprendre la cinétique EET sous-jacent et mécanismes et son lien avec la physiologie microbienne, OM c –Cyts ont été étudiés à l’aide de cellules entières électrochimie4,7, combinée avec la microscopie 8 , 9,10,de spectroscopie11et biologie moléculaire2,4. En revanche, méthodes pour étudier l’impact du transport de cations EET-liés, par exemple, les protons et sur la cinétique EET dans les cellules vivantes ont été guère établies, malgré le transport de protons à travers les membranes bactériennes ayant un rôle essentiel dans signalisation, homéostasie et énergie production12,13,,14. Dans la présente étude, nous décrivons une technique pour examiner l’impact du transport de protons sur la cinétique EET dans la cellule de MR-1 S. oneidensis à l’aide de mesures électrochimiques cellule entière, qui nécessite l’identification de l’étape cinétiquement limitante dans microbienne de production actuel15.
Une façon directe pour évaluer la contribution du transport de protons sur le EET associé est l’effet isotopique du deutérium (KIE). La KIE est observable comme le changement de cinétique de transfert d’électron sur le remplacement de protons avec des ions de deutérium, qui représente l’impact du transport de protons sur les électrons transfert cinétique16. La théorie de KIE lui-même a été clairement établie à l’aide de mesures électrochimiques avec enzymes purifiées,17. Toutefois, étant donné que la production actuelle en S. oneidensis MR-1 résulte de multiples processus variés et fluctuants18, on ne peut pas simplement identifier EET que le processus de limitation de vitesse. Pour observer la KIE sur les processus de transport de protons couplés avec EET, il faut confirmer que la production actuelle microbienne est limitée par transport d’électrons par l’intermédiaire de OM c– Cyts à l’électrode. À cette fin, nous avons remplacé la solution surnageante avec un milieu frais contenant une forte concentration de lactate comme donneur d’électrons au pH optimal et des conditions de température avant mesure KIE ; Ce remplacement a servi deux rôles : (1) il amélioré le taux des processus métaboliques en amont par rapport à l’EET et (2) omis les cellules de natation dans le surnageant détache le biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 sur la (électrode de travail électrode d’oxyde d’étain dopé (ITO) indium). Le protocole détaillé présenté est destiné à aider les nouveaux praticiens maintenir et confirmer que le processus EET est l’étape cinétiquement déterminante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre essai électrochimique cellule entière a plusieurs avantages techniques par rapport à l’électrochimie de protéine. Tandis que la purification de la protéine nécessite des procédures fastidieuses multi-étapes, notre méthode de cellule entière prend une journée de formation de biofilm auto-organisé après culture cellulaire. Pour parvenir à une interaction stable entre OM c– Cyts et l’électrode, nous avons besoin seulement de stérilisation et de nettoyage de la surface de l’électrode ;…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu financièrement par une subvention pour spécialement favorisé la recherche de la Japan Society for Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Number 24000010, 17H 04969 et JP17J02602, la nous Bureau du Naval Research Global (N62909-17-1-2038). Y.T. est chercheur JSPS et pris en charge par JSPS grâce au programme pour les écoles supérieures menant (mérite).
Materials
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
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